[发明专利]一种草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，还涉及一种草鱼呼肠孤病毒的检测方法。

背景技术

草鱼出血病是传染性、致病性都很强的一种严重病毒性疾病，主要危害草鱼鱼种。1972年首次在湖北滠口发现，并命名为草鱼出血病。1978年首次通过电镜观察证实该病原为病毒。1983年首次分离出爆发性草鱼出血病病原，并根据其形态学、理化特性等研究鉴定该病毒为呼肠孤病毒。1991年国际病毒分类委员会第五次会议将该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV),并纳入呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，现在已有资料证实该病毒是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，目前国内已报道了20多个分离株。

对草鱼呼肠孤病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法，细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等经典方法较为复杂，目前国内外检测草鱼呼肠孤病毒最常用的还是免疫学检测方法及RT-PCR方法等。免疫学方法在敏感性和特异性上有待提高，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题。RT-PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适用于现场快速检测及基层普及应用。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO 00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)是在反应液中加入一定量的逆转录酶，实现RNA的一步扩增。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短反应时间。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的GCRV-104毒株的S8基因片段编码区序列(HM234682.2)，应用PrimerExplorer V4在线软件设计特异性引物，利用RT-LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对草鱼呼肠孤病毒GCRV-104进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒的检测方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，能检测GCRV感染的细胞（例如CIK细胞），非常适用于GCRV的现场快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种草鱼呼肠孤病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：1×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；AMV逆转录酶（BBI）；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，DTT（Invitrogen）,1000×SYBR Green I（Invitrogen）。

F3：5’-CAGTGTGATCTCGACTTCCG-3’，即为SEQ ID NO.1；

B3：5’-AGACCAACGCGTCAATCG-3’，即为SEQ ID NO.2；

FIP：5’-CGGTCGTCTGACGTACACCGTTTTTTGCCGGCATATGGGGTAA-3’，即为SEQ IDNO.3；

BIP：5’-AGTTGGGTCAATTGGCTACGGTTTTTAGCACCATGGTACTGTTCG-3’，即为SEQIDNO.4。

一种草鱼呼肠孤病毒的检测方法，其步骤是：

1、病毒RNA的获取：

采用或LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。

2、RT-LAMP扩增：