[发明专利]一种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物材料，特别是一种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法及其在制备组织工程支架中的应用。

背景技术

组织工程学（Tissue Engineering）是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物的一门新兴学科。人体组织的病损会导致严重的功能障碍。目前的修复方法主要包括自源性移植、异源性移植和人造材料移植。自源性移植和异源性移植均是移植来自人体的组织，只不过自源性移植的是来自患者本身的组织，而异源性移植的是来自他人的组织。但是不论是自源性移植还是异源性移植均受到组织源缺乏，形状、大小等不匹配，可能会造成额外伤害等的限制。因此使得组织工程学逐步兴起。

组织工程支架（Tissue engineering scaffolds）可用于不同的人体组织，一般需要具有三维、多孔且主要孔相互连接的结构，是细胞粘附、增殖和再生为组织的基础，是细胞生长的细胞外基质的替代物。因此组织工程支架材料除了应当满足特定的组织对机械性能的要求、具有良好的生物相容性及生物可降解性之外，最为重要的是其必须还要具有一定的生物活性，即应该能够积极地促进细胞在其表面的粘附、增殖和分化。目前，常用的组织工程支架材料主要分为天然生物材料和人工合成材料。前者主要有壳聚糖、藻酸盐、纤维蛋白凝胶等。这类材料虽然通产具有良好的生物相容性和生物可降解性，但是其机械强度普遍不足。而后者主要有聚乳酸PLA、聚酯类如PLGA等，但是其吸水能力较差，对于细胞的粘附能力较弱，某些产品的降解产物还可能对人体造成毒害。

石蜡又称为晶型蜡，通常是白色或无色的无味蜡状固体，熔点47℃左右，不溶于水，可溶于醚、苯等有机溶剂。常用于食品或其他组分或包装材料。

生物纤维素材料是近年来新兴一种生物材料，其是通过醋酸菌属（Acetobacter）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）和八叠球菌属（Sarcina）等中的某些微生物发酵制得，其具有独特的超精细网状结构，因此具有良好的生物相容性及生物可降解性以及良好的机械性能。此外，生物纤维素具有良好的吸水性，且即使在高含水量的情况下，仍然能够保持良好的机械性能。

但是传统的生物纤维素材料，虽然能够使细胞粘附于其表面，但是由于其纳米纤维形成的空间网状结构十分致密，细胞的粘附性并不好，而且细胞的移动和营养物质的渗透均存在困难，因此其在组织工程学中并不能获得良好的技术效果。

发明内容

针对现有技术中的上述缺陷，本发明首先提供一种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法，其包括如下步骤：

1）制备固体石蜡微球并低温灭菌；

2) 在生物纤维素的制备培养基中加入灭菌的固体石蜡微球；

3）接种生物纤维素凝胶产生菌种，进行发酵；以及

4）在发酵结束后，将发酵获得的生物纤维素凝胶材料水浴加热到50-60℃，保持10-20分钟，然后趁热进行过滤，分离出石蜡即获得多孔性生物纤维素凝胶材料。

上述的固体石蜡微球可以通过包括如下步骤的方法制备：将石蜡融化，通过喷雾设备喷雾到冷的、与石蜡不互溶的介质中，待石蜡凝固形成微球后固液分离得到固体石蜡微球。

例如可以将石蜡熔化后喷雾到冷水中即形成固体石蜡微球。

还可将分离出的固体石蜡微球进行冷冻干燥处理以进一步固型。

固体石蜡微球的灭菌，可以是在形成微球之前进行高温灭菌，或在形成微球之后进行低温灭菌。可以采用的灭菌方法有，例如，固体石蜡高温加热熔化，即同时进行了灭菌处理，再在无菌条件下将其喷雾到冷的无菌水中，形成无菌的固体石蜡微球。灭菌方法还可以是：将其在浓度为70%的乙醇溶液总浸泡6-12小时，取出后再在无菌条件下用无菌水漂洗。灭菌方法还可以采用紫外线照射等本领域其他已知的手段。

固体石蜡微球的直径优选是200-600微米，更优选是300-400微米。固体石蜡微球的直径可以通过调整喷雾时喷嘴的尺寸，液体石蜡的流速来进行调整。

上述固体石蜡微球的用量为培养基体积的40-65%（v/v），更优选为培养基体积的50-55%。

上述的发酵优选使用静态浅盘发酵，发酵条件为：28-35℃,发酵5-10天。发酵条件优选30℃,发酵7天。

上述方法中，优选在发酵完成后，将多孔性生物纤维素材料浸泡在碱性溶液中一段时间后，在用去离子水反复洗涤，以去除其表面附着的培养基和菌体。优选用0.05-2M的氢氧化钠溶液浸泡1-4小时。