[发明专利]利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物和水产养殖的交叉领域，特别是一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法。

背景技术

芽孢杆菌，芽孢杆菌（Bacillaceae），细菌的一科，能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌。它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。芽孢杆菌有如下优点：（1）保湿性强：形成强度极为优良的天然材料聚麸胺酸，为土壤的保护膜，防止肥份及水份流失；（2）有机质分解力强：增殖的同时，会释出高活性的分解酵素，将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物质；（3）产生丰富的代谢生成物：合成多种有机酸、酶、生理活性等物质，及其它多种容易被利用的养份；（4）抑菌、灭害力强：具有占据空间优势，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的的生长繁殖；（5）除臭：可以分解产生恶臭气体的有机物质、有机硫化物、有机氮等，大大改善场所的环境。目前，芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆杆菌、乳酸杆菌等等）已被广泛的应用于环保、农业、畜牧业等多个领域。

例如，芽孢杆菌能提高动物生产性能是其产生多种消化酶的一个重要体现。研究表明，芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等，这些酶能够破坏植物饲料细胞的细胞壁，促使细胞的营养物质释放出来,并能消除饲料中的抗营养因子，减少抗营养因子对动物消化利用的障碍。如：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌可用于畜牧水产饲料添加剂、用于水环境净化；多粘类芽孢杆菌具有固定分子态氮的能力。

然而，目前为止用于水质净化的芽孢杆菌的发酵生产工艺可分为固体发酵和液体发酵两大类。而液体发酵涉及到菌体离心、冷冻干燥等步骤，生产周期长，生产工艺复杂，且所需的仪器设备价格昂贵，生产成本高。相对于液体发酵，固体发酵的生产成本相对较低。而且培养基含水量少，废水废渣少，环境污染少，容易处理；消耗低，功能设备简易培养基原料多为天然基质或废渣，广泛低廉；设备技术简易，后处理方便；产物浓度较高。但是固体发酵工艺参数难检测和控制；产品少，操作消耗劳力多，强度大。

目前所应用于生产芽孢杆菌的固体发酵主要包括粗放式的浅盘发酵培养以及固体发酵罐培养两种。其中粗放式的浅盘发酵方式较容易受外界环境干扰尤其是气温以及湿度的影响，在气温较高时很容易染菌，导致其可控性差。而全封闭式的发酵罐培养方式要求发酵罐设备本身的成本较高，且已形成的生产工艺产量很难再有大幅度提升。为了进一步降低发酵成本、提高发酵单位，我们迫切地需要一种新型的固体发酵生产工艺来取代目前已成型的发酵工艺来应用于大规模生产芽孢杆菌以满足我国目前对芽孢杆菌的极大的需求量。而且，目前为止关于芽孢杆菌的半封闭式的固体发酵培养方式还未见报道。

传统的固体发酵和标准化的液体发酵，都不能解决产品性能不稳定和成本高等问题。利用食用菌的废弃菌包，结合液体发酵和固体发酵的工艺流程，优化出一套成本低、性能稳定的新型发酵工艺，对微生物产品在环保、农业、畜牧业等领域的普及推广起到很大的作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低，产出高，性能稳定的利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法。

实现本发明目的的技术解决方案为：

一种利用废弃食用菌菌包发酵兼性厌氧芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤一：菌体复壮：在无菌条件下，从液体石蜡保存的芽孢杆菌试管中挑取一环芽孢杆菌于灭菌后的生理盐水中，然后放于80℃的恒温水浴锅中10 min，将此菌悬液摇匀并稀释成不同浓度，吸取100 uL分别涂布在无菌平皿中，37℃倒置恒温培养24h，个体较壮的菌落即可作为目的菌落；

步骤二：菌体扩培：挑取复壮后的目的菌划线于装有无菌固体LB培养基的茄形培养瓶中，37℃恒温倒置培养24h；用无菌水冲洗茄形瓶中的菌落，将冲洗下的菌悬液接入装有液体LB培养基的三角瓶中继续扩大培养，37℃恒温振荡培养24h。然后三角瓶中的菌悬液再接入200升的液体发酵罐中37℃恒温培养。24小时后再将此菌悬液接入2000升的液体发酵罐中；