[发明专利]罗非鱼重组口服蛋白TAT-GH及制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离重组的基因，其特征在于，其序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种分离重组的融合蛋白，其特征在于，其序列为SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达权利要求2所述融合蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于：大肠杆菌( Escherichia coli )BL21（DE3）pET-32a-TAT-tmGH，F^-ompT hsdS_B(r_B^-m_B^-)gal dcm(DE3)；CCTCC NO：M2012148。

4.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤为： 

A. 罗非鱼生长激素基因的制备: 取已处死的新鲜雄性罗非鱼脑垂体，液氮研磨，Trizol法提取GH的总mRNA后，以Oligo(dT)₂₀为引物通过RT-PCR 得到cDNA，同时设计GH的PCR上下游引物， 扩增得到 GH 基因；最后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏；

GH的上游引物P1：5’-CGGGATCCATGAACTCAGTCGTCCTCCA-3’；

GH的下游引物P2：5’-CGGAATTCCTACAGAGTGCAGTTTGCCTC-3’；

B. TAT-GH融合基因的制备：以GH基因为模板，采用PCR重叠延伸技术在GH序列的前端分步PCR依次加上长度为33个碱基的TAT序列，PCR扩增得到TAT-GH基因；最后克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌JM109，用于基因的增殖和保藏；

C. 融合基因表达载体的构建：双酶切重组质粒pGEM-T-TAT-GH和质粒pET-32a, 胶回收，T4连接酶进行连接，转化E.coliDH5a，涂布含有100μg/mlAmp⁺的LB平板，挑取单菌落，进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定，所得到的阳性克隆子是含TAT-GH融合基因的大肠杆菌；

D. 大肠杆菌基因工程菌的制备：将质粒pET-32a-TAT-GH转化到表达菌株BL21（DE3）中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达TAT-GH的大肠杆菌基因工程菌株；

E. 基因工程融合蛋白的制备：将步骤D中获得的基因工程菌转接到2×YT培养基中，经IPTG诱导，融合蛋白TAT-GH以包涵体的形式高效表达。

5.权利要求2所述的TAT-GH融合蛋白在罗非鱼促生长中的应用。