[发明专利]一种贝类snRNA U6基因及其引物和应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说是一种贝类snRNA U6基因的全序列及其引物应用于贝类microRNA的表达分析。 

背景技术

贝类，属软体动物门中的瓣鳃纲（或双壳纲），常见的种类有牡蛎、贻贝、蛤、蛏等。现存种类1万种左右，其中80％生活于海洋中。贝类中绝大多数种均可食用，很多贝类的肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。 

MicroRNA（miRNA)是一类在生物界中广泛存在的小分子非编码单链RNA，长约21～24nt，它能通过降解或抑制互补的靶mRNA来进行转录后基因表达调控，并且在生物的各个发育时期和不同的组织器官中广泛表达，参与到生物的各种生理活动中，因其在生物中的重要性，近几年国内外科学家对miRNA的研究倍加重视。对贝类microRNA的研究有助于推动贝类养殖业的发展。贝类中只报导了65条microRNA（miRBase 18)，且暂时没有可用于microRNA定量的内参基因报导。 

目前对miRNA的表达分析主要有大规模测序，基因芯片和实时荧光定量法。大规模测序和基因芯片法为高通量方法，成本很高，不适于少量miRNA的功能分析。而基于SYBR Green染料荧光定量PCR的miRNA相对定量法，参见文献：【Shi R,Chiang VL(2005)Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR.Biotechniques 2550 39:519-525.】表达分析有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势，广受研究人员的欢迎。而在相对定量中，内参的选择尤为重要。 

目前内参的选择大多数采用一些表达相对恒定的管家基因，如U6，5S rRNA等。U6基因是一种核剪切子RNA，参与到pre-mRNA的加工剪切，它的序列比较保守，在不同的物种中同源性高，参见文献【Brow DA,Guthrie C(1988)Spliceosomal Rna U6 Is Remarkably Conserved from Yeast to Mammals.Nature 334:213-218.】。但是目前在贝类中的U6基因序列尚未被克隆，也没有基于贝类U6基因设计的引物。 

发明内容

本发明的目的是提供一种贝类microRNA定量的内参基因及其引物。即为基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法表达分析中的内参基因及引物。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种贝类small nuclear RNA U6基因，具有序列表SEQID No:1中碱基序列。 

根据权利要求所述基因设计的一对内参引物，其特征在于：用于基于荧光定量PCR的miRNA相对定量法中，其以polyA加尾反转的cDNA为模板的内参引物： 

Sense primer：  5’ -CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGA-3’ 

Anti-sense primer：  5’  -TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTGTCATC-3’。 

所述基因或引物作为内参基因在相对定量法实时荧光定量PCR中的应用。 

所述基因或引物作为相对定量中的内参基因在实时荧光定量PCR的贝类microRNA表达分析中的应用，它们的作用在于校正上样量，上样过程中的实验误差，保证实验的准确性。 

具体步骤为： 

a.候选miRNA序列的获得：从已有数据库或其它来源获得欲做表达分析的miRNA序列。 

b.引物设计：根据获得的候选miRNA序列设计该miRNA相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3％的琼脂糖胶检测条带单一)。 

c.PCR模板的准备：在收集的样品中用E.Z.N.A.^TM miRNA kit(试剂盒，市购于OMEGA公司)提取<200nt的small RNA后，用One Step miRNA cDNA synthesis Kit(试剂盒，市购于TaKaRa公司)按照说明书加polyA尾后反转成cDNA。 

d.荧光定量PCR反应：用miRNA相应的特异引物和universal reverse primer(由上述TaKaRa试剂盒提供)以U6基因为内参在ABI 7500FASTreal-time PCR仪中进行。