[发明专利]利用桑黄发酵生产漆酶的方法

说明书

技术领域

    本发明属于生物发酵制剂技术领域，具体涉及一种利用桑黄发酵生产漆酶的方法。

背景技术

漆酶（Laccases）是一种结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，该酶最早是在漆树的汁液中发现的，故将其命名为漆酶。此后在多种植物、高等真菌、少数细菌及昆虫体内均有发现。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保型酵素。由于这几年环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶也成为众多学者的研究对象。 

漆酶独特的催化特性使其在生物检测中有广泛的应用，作为高效的生物检测器而成为底物、辅酶、抑制剂等成分分析的有效工具和手段，在生物制浆、生物漂白、以及有毒化合物的降解等方面具有潜在应用价值，因而引起人们越来越多的研究兴趣，成为环境保护用酶研究的热点。近年来，人们对漆酶的研究越来越深入，其应用的范围也越来越广泛。

漆酶属于蓝-铜族氧化酶，其活性中心由4个铜原子组成，在氧化还原反应中起着决定作用。漆酶的Ⅰ型铜原子和氨基酸残基结合成为单核中心，是酶表现为明显的蓝色。另外，它还包含Ⅱ型和Ⅲ型铜原子，构成三核中心。Ⅰ型铜原子作为初级电子的接受者，参与分子内的电子传递，把电子从底物传递到其他铜原子上，然后电子结合于三核位点。该位点进一步把电子传递给结合活性中心的第二底物氧分子，使之还原为水，而铜的存在是形成复合体所必需的。它们催化的反应是利用分子氧，产生的副产物只有水，所以又称漆酶为“生态友善酶”。

尽管漆酶在自然界中广泛分布，但真正具有较高漆酶产量的菌株并不多，分泌漆酶的真菌主要分布于担子菌（Basidiom ycotina）、多孔菌、子囊菌、脉胞菌（NeurosPora）、柄孢壳菌和曲霉菌等属种，其中最主要的是担子菌亚门的白腐菌真菌，研究也较多。但是大部分真菌发酵周期较长，使得工业化生产具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵周期较短、能实现工业化生产的利用桑黄发酵生产漆酶的方法。

本发明所采用的技术方案是：

利用桑黄发酵生产漆酶的方法，其特征在于：

由以下步骤实现：

步骤一：配置发酵培养基，培养基的重量配方为：玉米粉0.5～1.5%、麸皮0.3～1.5%、葡萄糖0.5～2.0%、蛋白胨0.3～0.9%、酵母膏0.1～1.0%、KH₂PO₄0.05～0.15%、MgSO₄0.01～0.06%、添加Cu²⁺浓度30～60μmol/L、维生素B₁1mg/100mL；

步骤二：取生长在斜面上的桑黄菌丝体黄豆大小接入配制好的发酵培养基中，采用300mL三角瓶装发酵培养基，装液量为100mL，旋转频率150r/min，28℃培养60h，过滤得桑黄发酵液；

步骤三：取步骤二得到的桑黄发酵液100mL, 经4000r/min、4℃离心15min，弃去菌丝体，取得的上清液即为粗酶液；取4ml缓冲液和1ml粗酶液，混匀，30℃恒温水浴反应30min，得到目的酶。

步骤三中的缓冲液是指，每1L缓冲液中包含有1.0mmol的愈创木酚和50mmol的琥珀酸，其中琥珀酸的pH为4.5。

    本发明具有以下优点：

1、发酵周期短并且获得的漆酶酶活力高：该桑黄菌株与已报道的白腐真菌相比，具有发酵周期短且产漆酶酶活较高的优点，发酵周期96h，漆酶产量达126000U/L。

2、制备过程原料资源丰富，环保：目前发酵培养桑黄发酵液的原料主要是玉米粉、麸皮、白砂糖等，在整个漆酶制备过程中无任何废物或排放物产生，符合节能环保要求。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

桑黄，俗称鲍氏层孔、火木层孔、针层孔等，属于担子菌纲、多孔菌目，多孔菌科，层孔菌属，是近几年开发的一种多年生药用真菌。通过对其产酶培养条件的初步研究，发现培养基组分对其产酶能力具有较大的影响，在优化后的培养基组分下发酵，漆酶酶活由优化前的7666U/L提高到126000U/L，提高了16倍，且发酵周期短，具有工业化生产的潜力。