[发明专利]一种紫云蛤科贝类线粒体COI基因扩增引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫云蛤科线粒体COI[the cytochrome c oxidase I]基因的扩增引物。 

背景技术

紫云蛤科(Corbiculacea)隶属于双壳纲(Bivalvia)，异齿亚纲(Heterodonta)，帘蛤目(Veneroida)，全部海产，广泛分布于中国沿海，日本、菲律宾和印度洋。该科贝类种类较多，中国已知约25种，通常埋栖于潮间带至浅海细沙或泥沙质海底。紫云蛤科的贝类多数肉质鲜美，营养价值高，具有重要的经济价值。例如，中国紫蛤、双线紫蛤、紫彩血蛤和尖紫蛤都是名贵的海珍品。然而由于紫云蛤科种类的贝壳外部形态高度可塑性和外套窦形态高度相似性，利用形态特征对紫云蛤科进行物种分类和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些亲缘物种，单利用形态学数据很难区分开来。而且，近年来由于过度捕捞等原因，其种质资源已明显消退，紫云蛤种质资源合理利用和保护亟不可待。 

关于紫云蛤的增养殖和生物学特征等方面研究已有报道，但是基于分子标记的遗传多样性的研究开展较少，这种现状极大的阻碍了紫云蛤种质资源的开发利用和保护。线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因其单亲遗传、无重组、中性进化等特性，在分子遗传学研究中发挥着重要作用。其中，COI基因作为进化速率相对较快的区域，在无脊椎动物系统分类、种类鉴别、群体遗传多样性和分子进化方面得到广泛应用，已成为区分物种和研究物种进化关系的理想基因。因此，利用mtCOI基因对紫云蛤科进行物种鉴定和系统发育分析是一种很好的方法。 

由于Folmer(1994)设计的通用引物COIL1490和COIH2198在紫云蛤中扩增结果不理想(即琼脂糖电泳检测大部分个体无扩增条带)，因此，开发研究紫云蛤科线粒体COI基因扩增专用引物，对利用分子方法鉴定紫云蛤科物种和进行系统发育分析具有重要的意义，同时也能为利用COI基因保护紫云蛤科种质资源提供技术条件。 

发明内容

本发明的目的是提供一种紫云蛤科线粒体COI基因适用性好的扩增引物，它能满足现有技术的上述需求。 

本发明根据紫云蛤科物种mtCOI序列变异度较高和非特异性扩增引物扩增效率低的特性，通过重复试验筛选出紫云蛤科mtCOI基因的扩增引物。采用本发明的紫云蛤科线粒体mtCOI基因的扩增引物，可以有效的扩增出紫云蛤科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究紫云蛤科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护紫云蛤科种质资源具有重要意义。 

具体实施方式

本发明的紫云蛤科线粒体COI基因的扩增引物的筛选方法采用三个步骤：a、利用COI 通用扩增引物(LCO1490F和HCO2198R，Folmer 1994)扩增出部分紫云蛤科物种的COI序列；b、从上述得到的部分紫云蛤科COI序列中，通过比对找出保守的序列片段，合成多套扩增引物序列；c、从合成的多套扩增引物序列中筛选出扩增紫云蛤科线粒体COI基因效果最好的一对引物。 

下面结合实施例对本发明作进一步说明： 

1.样品采集：于2002年～2010年，从中国南北沿海共采集紫云蛤科4个属10个种类的200个个体。 

2.DNA提取：用苯酚-氯仿法对所采集样品进行DNA提取。 

COI通用扩增引物扩增：利用Folmer于1994年设计的COI通用扩增引物 

LCO1490F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 

HCO2198R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ 

对上述采集的紫云蛤科200个个体进行PCR扩增。不同物种的PCR热循环退火温度不同，退火温度范围为42～56℃。扩增产物经1.5倍的琼脂糖电泳检测后，送往测序公司进行双向测序。用Lasergene软件将测得的序列进行人工矫正。最终获得5个种类64个个体的COI序列，其长度约为650bp，其余个体均未扩增出。 

3.序列比对：利用CLUSTALW软件将上述测得的64个个体的COI序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。 

4.引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出3对扩增引物。