[发明专利]优化的乳糖酶基因及其分泌表达方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及乳糖酶优化基因，尤其涉及将来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的乳糖酶原基因进行密码子优化后所得到的乳糖酶优化基因，本发明还涉及该乳糖酶优化基因在制备重组乳糖酶中的应用，属于乳糖酶的制备领域。

背景技术

乳糖酶（β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galactohydrolase，EC3.2.1.23）具有水解和转糖苷的双重作用。一方面，人们利用其水解功能生产低乳糖乳制品来解除乳糖不耐受患者因食用乳制品而引起的多种不良反应；另一方面，可利用其转糖苷特性的作用生产具有良好保健作用的低聚半乳糖(Hydrolysis of lactose:aliterature review.Journal Name:Process Biochem.;(United Kingdom);Journal Volu-me:20:11985,Medium:X;Size:Pages:2-12.)。乳糖酶广泛存在于植物、微生物以及动物肠道细胞中。目前，商业化生产的乳糖酶主要来源于曲霉（Aspergillus sp.）和克鲁维斯氏酵母（Kluyveromyces sp.）这两个属的微生物发酵。克鲁维斯氏酵母是从牛乳中分离到的，其产生的乳糖酶最适pH与新鲜牛乳的天然pH(6.6～6.8)相近，主要适用于分解牛乳及脱脂奶粉中的乳糖，该酶在pH6.2～7.0稳定，6.2～7.0以上或以下酶活迅速下降。最适温度为35～40℃。分子量为135kDa。40℃处理1h，pH在6.5～8.5之间稳定。40℃以上就急剧失活(谢毅等，复旦学报(自然科学版)，1999，Vol.38,No.5:523-528)。从曲霉所得的乳糖酶pH较低，而且在高温下有活性，分子量为106kDa，最适温度60℃，最适pH在3.5～5.0。从霉菌来的乳糖酶的最大特点是热稳定性高，最适pH值低，这样在食品工业上就不容易受到微生物的污染，更具有应用价值。

由于原始菌株生产的乳糖酶产量低，无法满足工业生产的要求，因此本领域研究人员试图利用基因工程手段来提高乳糖酶的表达量。特别是利用毕赤酵母和曲霉表达系统在提高乳糖酶的表达水平上取得了较大进展。Berka(US 5,736,374)公开了一种提高曲霉乳糖酶表达的方法，该方法将产乳糖酶的米曲霉(A.oryaze)CCC28菌株通过紫外、NTG诱变处理获得乳糖酶表达量较高的突变株CCC161(ATCC74285)(亲本乳糖酶分泌量为5U/ml，突变株分泌量为50U/ml)，以其为受体，将其自身的乳糖酶基因置于GalA启动子之下导入其中，所筛选的阳性克隆子中的乳糖酶蛋白表达量为1g/L发酵液，乳糖酶活性达500U/ml以上，比原始菌提高了100倍。本发明人公开了一种性质优良的乳糖酶编码基因的克隆、高效表达乳糖酶的重组毕赤酵母的构建以及重组酵母的高密度发酵大量产生乳糖酶的方法，重组酵母中乳糖酶的表达量可达到6mg/ml发酵液，酶活达到3600U/ml，高效表达乳糖酶的重组酵母可用来大规模工业化廉价生产乳糖酶（授权公告号：CN 1233826C，发明名称：一种重组毕赤酵母乳糖酶及其应用）。Machida,M.等报道了一种从米曲霉（Aspergillus oryzae）中分离、克隆的乳糖酶基因（Machida,M.,Asai,K.,Sano,M.,et.al,Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae,Nature,2005,438(7071),1157-1161），该乳糖酶基因在酵母细胞中的分泌表达水平较低，所表达的乳糖酶酶活不高，限制了其在工业化扩大生产中的应用。

发明内容

本发明目的之一是提供一种密码子经过改造且mRNA二级结构稳定性好的乳糖酶优化基因，该乳糖酶优化基因在宿主细胞中的分泌表达量高；

本发明目的之二是提供含有该乳糖酶优化基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明目的之三是将所述乳糖酶优化基因以及含有该优化基因的重组表达载体和重组宿主细胞应用于生产重组乳糖酶；

为实现上述目的，本发明首先将米曲霉（Aspergillus oryzae）乳糖酶基因进行修饰改造得到乳糖酶优化基因(lacm)，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。