[发明专利]一种小鼠淋巴细胞诱变方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种小鼠淋巴细胞诱变方法。

背景技术

干细胞作为机体组成的起源细胞，具有多向分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的祖宗细胞。干细胞在形态上通常具有共性，呈现出圆形或椭圆形形态，干细胞体积较小，细胞核相对较高大。干细胞作为一种尚未充分分化和成熟的细胞，在诱导环境条件下具有形成各种组织器官组成细胞的潜在功能，被医学界称之为“万能细胞”。干细胞的用途非常广泛，涉及到医学的多个领域。干细胞具有较强的自我更新和增殖能力，目前已成为转基因的载体细胞。胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)则具有二倍体生殖嵌合和四倍体互补诞生后代的能力，为动物的遗传育种和新品种培育奠定了基础，ES细胞还具有在体外诱导分化形成精子和卵子的能力，因此，是一种重要的遗传资源用于动物生殖发育的各个方面。

获得来源于自身机体遗传性能一致的干细胞是当前干细胞研究的热点，2006年日本科研人员Takahashi第一次报道通过外源性导入四种限定基因Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4使小鼠皮肤成纤维细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPS细胞）后，到目前为止，已从包括人、猴、大鼠、猪和牛等多个物种、多种类型体细胞中成功诱导产生iPS细胞，从而人类能够成功使成体细胞重编程形成干细胞。但是，研究发现iPS细胞的产生过程中需要病毒介导限定基因才能够获得成功。因此，病毒作为潜在的致癌因子限制了iPS细胞的临床应用。目前，寻找一种无公害体细胞形成干细胞的自然诱导方法是当务之急。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠淋巴细胞诱变方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种小鼠淋巴细胞诱变方法，包括以下步骤：

（1）淋巴细胞的分离

取绿色荧光蛋白转基因小鼠，绿色荧光蛋白转基因小鼠为商品化转基因小鼠，颈部脱臼处死，酒精腹部消毒，在无菌条件下打开腹腔，取出小鼠脾脏，PBS液洗涤后，在200目尼龙网膜内轻轻研磨形成单个细胞，并经PBS液洗涤后收集，离心去上清液，用无血清DMEM培养液重悬备用；

（2）小鼠ES细胞的培养

取12.5 天小鼠胎儿成纤维细胞用高糖DMEM培养液进行培养，待细胞铺满培养皿后，用含2.5 mg/ml胰酶-0.2mg/mlEDTA的细胞消化液消化传代培养，取铺满培养皿的胎儿成纤维细胞用10 μg/ml的丝裂霉素作用2.5 小时，用含2.5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的细胞消化液消化后接种至0.1%明胶处理的培养皿上于培养箱中进行培养，取接种后第3天均匀铺满培养皿的细胞用作饲养层；小鼠ES细胞R1细胞系为商品化细胞系，取第26代小鼠ES细胞R1细胞系接种到小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养，小鼠ES细胞每两天传代一次；

（3）淋巴细胞与ES细胞的融合

用含2.5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的细胞消化液消化小鼠ES细胞，收集离心去上清液，用无血清DMEM培养液重悬，把小鼠淋巴细胞与ES细胞按1：2~10比例进行混匀，离心去上清液，用50%PEG溶液进行作用90秒，无血清DMEM培养液稀释重选，离心去上清液，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培养液，接种细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行培养；

（4）诱变细胞的分离培养

培养2天后，荧光显微镜下选择表达绿色荧光蛋白的细胞集落，在显微镜下分选细胞克隆集落，接种到新的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上，添加含1000 U/ml LIF的高糖DMEM培养液进行培养，细胞集落在饲养层上生长2天后，用含2.5 mg/ml胰酶-0.2 mg/ml EDTA的细胞消化液消化细胞集落，重新接种细胞于小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上进行扩增培养。

本发明的有益效果是：

淋巴细胞作为动物机体内的一种重要组成细胞，具有来源广泛、取材方面等优点，本发明借助细胞融合技术诱导小鼠淋巴细胞转变形成干细胞，形成的干细胞具有小鼠ES细胞的形态、基因表达、体外分化能力等特征，有效避免了病毒在干细胞诱导中的潜在危害。因此，该方法将为小鼠体细胞转变成干细胞并得到广泛应用奠定基础，同时，也为动物或人类的干细胞研究和利用提供重要借鉴。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。