[发明专利]一种转录因子基因功能验证的方法

权利要求书

1.一种转录因子基因功能验证的方法，通过以下步骤实现：

（1）电子克隆：根据已公布的或者自行构建待验证物种的转录本信息库进行电子克隆，自行构建该物种的转录本信息库时，所选样本要尽可能多且具有代表性，本发明以杨梅不同成熟度的果实以及不同组织为样本，抽提总RNA后进行深度测序，构建成杨梅转录本信息库，以此转录本信息库，根据bHLH转录因子的保守序列，采用Blast生物信息学手段，程序中阈值设为1×10^-5，从海量Unigene中筛出属于bHLH家族的Unigene，进一步分析Unigene，筛出可能与杨梅花青苷合成相关的Unigene，将相关的Unigene进行序列重叠性分析，得到2条拼接序列SEQ：NO. 5和SEQ：NO. 6，分别命名为MrbHLH1和MrbHLH2，首先采用普通PCR技术，对拼接的MrbHLH1和MrbHLH2进行验证，所用引物分别为SEQ：NO. 1和SEQ：NO. 2及SEQ：NO. 3和SEQ：NO. 4，然后再利用在线blastn算法，分析得到的MrbHLH1和MrbHLH2与其他物种中基因序列的同源性，采用Clustal对MrbHLH1和MrbHLH2及其他物种中调控花青苷合成的bHLH进行序列比对，分析MrbHLH1和MrbHLH2是否具有与其他物种中调控花青苷合成的bHLH相同的结构域，应用Mega 5.0分析MrbHLH1和MrbHLH2与其他物种中调控花青苷合成的bHLH的亲缘关系，进一步预测MrbHLH1和MrbHLH2是否具有调控花青苷合成的功能；

（2）实时定量荧光PCR分析转录因子基因表达模式：根据已确认的MrbHLH1和MrbHLH2的全长和3’端非编码区序列分别设计实时定量PCR特异引物，序列分别为SEQ：NO. 7和SEQ：NO. 8及SEQ：NO. 9和SEQ：NO. 10，PCR产物包含终止密码子，长度分别为109bp和162bp，引物的特异性通过普通PCR和序列测定双重手段进行验证，提取杨梅不同成熟度的果实RNA，取1 μl逆转录合成cDNA，然后稀释10倍，再将所用引物稀释至2.5 μM，参照Fermentas公司生产的Maxima                                                SYBR Green/ROX qPCR Master Mix试剂盒说明书配制PCR反应体系，应用iCycler iQ Q-PCR仪器（Bio-Rad，USA），反应条件为：50 ℃ 2 min；95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸30 sec，40个热循环；熔解曲线分析65 ℃到95 ℃，每5 sec升高1 ℃；反应结束后，根据每个模板对应的Ct值，以内参基因为标准将各成熟度果实的cDNA模板原液按照10×2^-(Ct-25)公式进行稀释，使所有模板Ct值均为±25，以序列是SEQ：NO. 11的实时定量特异引物和序列是SEQ：NO. 12的内参基因的特异引物进行荧光定量PCR，依据两者扩增效率的差异判断转录因子的相对表达量；

（3）超表达载体构建：根据MrbHLH1和MrbHLH2全长序列分别设计含限制性内切酶酶切位点的引物序列SEQ：NO. 13和SEQ：NO. 14及SEQ：NO. 15和SEQ：NO. 16，扩增两个基因的开放性阅读框，以杨梅成熟果实cDNA为模板，参照PrimeSTAR HS DNA polymerase说明书，配制终体积为20 μl PCR体系：2.5 U/μl HS DNA polymerase 0.2 μl，5×Buffer 4 μl，2.5 mmol/l dNTP 1.6 μl，10 μM/l引物各0.5 μl，50 ng/μl cDNA模板1.0 μl，加ddH₂O至终体积20 μl，按说明书推荐的PCR程序进行产物扩增，反应条件为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 sec，58 ℃退火5 sec，72 ℃延伸2 min 30 sec，35个热循环；72℃延伸10 min，4℃保存；

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，回收后经相应限制性内切酶处理，酶切产物再次用1%琼脂糖凝胶电泳，回收，然后连接到同样经相应限制性内切酶处理的pGreenⅡ0029 62-SK表达载体上；

将重组质粒导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，用不含任何抗生素的LB液体于37 ℃ 150 rpm培养细胞1 h后，然后将其均匀涂布于含50 μg/ml 卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，用pGreenⅡ0029 62-SK表达载体自带的SEQ：NO. 17和SEQ：NO. 18检测引物对阳性克隆进行菌液PCR验证，最后选取含目的基因的阳性克隆菌液送上海Invitrogen公司进行测序验证，根据公司测序结果，将正确的阳性克隆菌液置于37 ℃、150 rpm恒温摇床上过夜培养后进行质粒抽提，应用相应限制性内切酶处理抽提到的质粒，再次确认载体构建的正确性，将最终确认正确构建的表达载体通过电击导入GV3101::pSoup农杆菌感受态细胞中，菌液均匀涂布于含25μg/ml庆大霉素、5μg/ml四环素和50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上筛选阳性克隆，用20%灭菌甘油保存筛选到的阳性克隆，存放于-80℃；

（4）烟草叶片双萤光素酶瞬时表达分析：将存放于-80℃的甘油菌划线接种于含25 μg/ml庆大霉素、5 μg/ml四环素和50 μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28℃培养48 h，挑取少量菌落涂布到另一个含相同抗生素的LB固体培养基上，28 ℃培养24 h，刮取生长良好的菌落，用10 mM MgCl₂，10 mM MES，150 mM 乙酰丁香酮，pH 为5.6的渗透液悬浮，使其OD₆₀₀为0.75，含不同转录因子的菌株渗透液等比例混匀，再加入混合液1/10体积的含结构基因启动子的菌株渗透液，然后用无针头注射器将渗透液注入6周大的、有6-8片真叶的本氏烟草叶片中，3天后检测叶片中两种荧光素酶的比值：应用Promega提供的Dual-Luciferase Reporter Assay System和发光荧光检测仪分析LUC和REN的表达，将叶片于100μl 1×PBS缓冲液中磨碎，吸取50μl上清液，加入50μl Luciferase Assay Buffer避光反应10min后检测LUC荧光发光信号，再加入50μl Stop &Glo Buffer避光反应10min后检测REN荧光发光信号，分析不同转录因子间、转录因子与启动子间是否存在互作，验证转录因子在该代谢途径中的调控作用。