[发明专利]一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物体细胞胚胎发生，尤其是一种调控火鹤体细胞胚胎发生的SERK编码基因cDNA的构建方法及应用。

背景技术

火鹤(Anthurium andraeanum)又名红掌、安祖花，为天南星科(Araceae)花烛属(Anthurium)植物，原产南美洲热带雨林中。其花型独特，佛焰苞明艳华丽，色彩丰富，花期长，叶形别致，观叶观花俱佳，是现在居室不可多得的装饰珍品，世界花卉贸易中，红掌是仅次于热带兰的第二大热带花卉。我国在20世纪70年代引入栽培，目前已成为市场中名贵的切花品种。

火鹤常用分株繁殖，速度很慢，偶尔也用扦插等方法进行繁殖，但成活率很低，而用播种繁殖必须经过人工授粉才能获得种子，耗费人力，而且种子繁殖有较大变异，所以用常规方法难以扩大生产。目前，花烛组培快繁主要是通过器官发生途径：由不同外植体诱导形成愈伤组织，然后由愈伤组织诱导不定芽再生，进行继代增殖。通过器官发生途径获得再生植株并进行快速繁殖已成为一种较有效的繁殖方式，但仍存在外植体诱导愈伤组织周期较长，、无菌苗长期连续增殖极易发生退化和变异、接种工序中切割材料较耗人工等缺点。而通过体细胞胚胎发生途径再生植株在繁殖率、遗传稳定性等方面均具有许多优势，例如：继代培养中节省了人工切割材料的时间、一次性产生的体胚数量多，繁殖速度明显比器官发生途径快，遗传性稳定、不易发生体细胞变异，还可以用于遗传改良等。

Geie T.在1982年最先报道了通过培养花烛属火鹤的肉穗花序获得胚状体，但胚状体未能发育成苗。1992年Kuehnle A.R.等首次从花烛的叶片诱导出体细胞胚，他们用4种花烛杂交种幼苗的叶片在暗中培养一个月发现有半透明的胚胎发生。1997年Musa等研究发现，花烛属植物火鹤也存在体细胞胚胎发生途径。2002年，MBalachandran等在第26届国际园艺学会会议上报道了花烛品种‘DragonTongue’等不同外植体诱导体细胞胚获得成功，并用于遗传转化研究。2004年Duong Tan Nhut等通过实验获得花烛品种‘Tropical’的体细胞胚，并进行了人工种子萌发条件的研究。2006年Sompong Te-chato等研究了品种、培养基、外植体类型和刻伤对安祖花属植物器官再生和体细胞胚再生的影响。2008年Nydia del Rivero-Bautista等研究了花烛属植物试管苗叶片通过间接途径诱导胚性愈伤、体细胞胚的分化和萌发的最适激素浓度。

国内的研究则是从2006年才开始的，辛伟杰等以花烛盆花品种无菌苗叶片、叶柄、根段为外植体，对花烛体细胞胚胎发生及植株再生进行了研究，建立了花烛体细胞胚胎发生体系，并研究了相关的生理生化特征。2010年，许传营等以花烛品种Amigo为材料，研究了悬浮培养条件下花烛体细胞胚胎发生过程中相关生理生化特征。他还研究了花烛体细胞胚胎发生过程各阶段蛋白质组成变化，发现胚性愈伤组织阶段比体细胞胚胎形成阶段蛋白表达量高且多出3条特异蛋白质谱带。同年，刘雪莲等以火鹤亚利桑娜幼嫩叶片为外植体，筛选出了最优的愈伤诱导培养基和胚状体诱导及成苗培养基。

大量研究表明，体胚中绝大部分基因，如BBM（BABYBOOM）、WUS（WUSChEL）、LEC2（LEAFYCOTYLEDON2）和AGL15（AGAMOUS-Like15)等基因（Schmidt et al.，1997；Thomas，1993）具有提高体胚发生率或维持体胚发生的作用，但它们是在体胚发生后才起作用的，并不是在体细胞从营养生长向胚性生长的转化中起作用，而唯一例外的是SERK基因。

SERK（Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase）基因广泛地存在于单子叶和双子叶植物中，在不同的植物中存在着特定的表达方式。已经报道的除少数SERK基因的表达在体细胞胚内检测不到外，其他已经报导功能的SERK基因一般都参与了体细胞胚的发生，这表明SERK基因的表达与体细胞胚的发生密切相关。另外，有些研究表明SERK基因不仅参与促进体细胞胚的发生，还标志着体细胞从营养生长向胚性生长转变，预示着SERK基因可能会被发展成为体细胞胚发生的标记基因。分离并克隆火鹤体胚SERK基因cDNA全长序列，并从转录水平对不同培养阶段的各个时期SERK基因的表达量进行分析，是阐明SERK基因调控火鹤体细胞胚胎发生机制的重要步骤；缩短外植体诱导愈伤组织周期、减少接种工序中切割材料的人工耗费、高通量快繁火鹤种苗、提供遗传性稳定且不易发生体细胞变异的植株、提供高生活力种苗是繁育火鹤必须要解决的问题。

发明内容