[发明专利]水仙潜隐病毒检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水仙潜隐病毒检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，不仅适用于口岸检验检疫部门对水仙潜隐病毒的快速检测，还可应用于农业部门对水仙潜隐病毒的实时监测和预警预报。

背景技术

水仙潜隐病毒（Narcissus latent virus，NLV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）、柘橙病毒属（Macluravirus）成员。病毒粒体形态为直线或轻微弯曲线状，粒子大小约650nm×13nm。病毒基因组为正义单链RNA，全长尚未见报道。NLV主要通过汁液接触、蚜虫非持久性方式传播。该病毒可以侵染石蒜科（Amaryllidaceae）、鸢尾科（Iridaceae）、苋科（Amaranthaceae）、茄科（Solanaceae）、蝶形花科（Papilionaceae）植物，已报道的自然寄主包括黄水仙（Narcissus pseudonarcissus）、鸢尾（Iris xiphium）、剑兰（Gladiolus hybrids）、根希百合（Nerine sarniensis）。NLV常常和其他病毒混合侵染水仙，单独侵染水仙后引起叶片顶端产生褪绿黄色条斑，与其他病毒复合侵染时导致水仙植株出现花叶、斑驳、黄化、坏死、花箭减少、香味变淡以及矮化畸形等症状，造成水仙商品价值大幅度降低，严重影响或直接失去观赏价值。NLV分布在英国、荷兰、德国、意大利、以色列、澳大利亚、中国的水仙栽培区。由于水仙潜隐病毒（NLV）可随染病的植株及种球进行远距离传播，因此加强该病毒检测技术的研究，建立快速、准确和灵敏的检测方法对于预防该病毒的发生和扩散，保护水仙生产安全，具有极其重要的意义。

目前，水仙潜隐病毒（NLV）的检测方法主要包括生物学测定、血清学检测和电镜鉴定。生物学测定方法鉴定NLV是通过接种番杏、千日红、昆诺藜、菜豆和克利夫兰烟等相关寄主，然后根据产生的症状来进行判断，其中在番杏叶片产生圆形的局部褪绿斑，在千日红和昆诺藜上症状表现为局部枯斑，在菜豆和克利夫兰烟叶上则出现不规则的系统褪绿斑（谢联辉等，云南农业大学学报，1990，5（1）：17～20）。生物学测定方法的缺点在于需要专门的隔离温室或网室，检测周期长，结果易受外部因素影响，检测可靠性不高。血清学检测主要是采用间接酶联免疫吸附测定方法（Clark等，Australasian Plant Pathology，2000，29：227～229；谢联辉等，云南农业大学学报，1990，5（1）：17～20），通过抗原、抗体发生免疫特异性反应来进行测定，与生物学测定方法相比，该方法检测时间短、特异性和灵敏度明显提高，但该方法需要特异性强、稳定性好的抗血清，因抗血清制备较为复杂而导致检测成本提高。此外，血清学检测对于NLV含量低的样品以及其他与NLV有血清学关系的病毒样品，可能造成漏检或错检。电镜鉴定具有快速、直接的优点，但需要昂贵的仪器设备和具备一定操作技能的专业人员，因此难以普及推广。近年来，基于核酸水平的RT-PCR分子检测方法越来越多的应用到植物病毒检测领域，该方法与上述检测方法相比，时间更快、灵敏度更高、特异性更强、结果更可靠。但到目前为止，关于水仙潜隐病毒（NLV）分子检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于NLV检测的分子检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水仙潜隐病毒检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境水仙及田间水仙上水仙潜隐病毒进行快速、准确的检疫鉴定。

本发明技术方案如下：

（一）一种用于水仙潜隐病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）上游引物：浓度为10μmol/L，引物序列为5’-CGAACAAAGCAAGCGAACT-3’；

2）下游引物：浓度为10μmol/L，引物序列为5’-AAGATAGGGCCTCTGGTCAAC-3’；

3）RT Buffer：5×；

4）RNA酶抑制因子：浓度为40U/μL；

5）反转录酶：浓度为200U/μL；

6）dNTPs：浓度为10mmol/L；

7）PCR Buffer：10×；

8）Mgcl₂：浓度为25mmol/L；

9）Taq DNA聚合酶：浓度为5U/μL；

10）水仙潜隐病毒的阳性对照样品；

11）不含水仙潜隐病毒的阴性对照样品；

12）RNase-free ddH₂O。