[发明专利]纳米粒径分析仪用于内毒素检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种内毒素检测方法，尤其涉及一种纳米粒径分析仪用于内毒素检测的方法，属于细菌内毒素检测领域。

背景技术

细菌内毒素为脂多糖，也被称为脂质体，其是革兰氏阴性菌细胞外壁的成分，广泛存在于自然界中，该物质进入人体血液会引起发热，俗称热原反应。由于此类物质可能致人产生严重的不良反应，因此在药物注射剂中需要严格控制。

细菌内毒素检测可以分为定性检测和定量检测两类。常规的检测方法为家兔法，将供试品静脉注入家兔体内，在规定的时间内观察体温的变化情况。该方法干扰因素多，灵敏度差，特别是对退热作用的药物或清热解毒类的注射剂可能还会出现假阴性。

药典中的内毒素检测均采用鲎试剂法，其中：鲎试剂凝胶法是在适宜的条件下（温度、pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶；鲎试剂浊度法是依据鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化与内毒素浓度呈线性关系，从而测定内毒素含量。这些方法准备期长，检测耗时，成本高，不能实现快速、连续、在线检测。

另有些方法的探索性研究较多，还未能形成应用，或者不能克服需添加试剂或使用昂贵仪器等缺点，无法实现对样品的直接检测。

发明内容

本发明针对现有技术的缺陷，而提出一种纳米粒径分析仪用于内毒素检测的方法，以降低成本并提高检测速度。

该方法包括如下步骤：

步骤1：制备系列浓度的内毒素标准溶液，采用纳米粒径分析仪对这些内毒素标准溶液进行粒径检测；

步骤2：对检测所得的粒径数据与相应内毒素标准溶液的浓度作回归分析，建立标准曲线ln(d)=k·C+b，式中：d为粒径，C为内毒素浓度，k为校正系数，b为修正系数；

步骤3：根据标准曲线计算出待测样品中的内毒素含量。

所述步骤1中的系列浓度包括至少三个稀释浓度；所述步骤2中的标准曲线的曲线评价系数大于0.98。

技术效果：

1、每个样品的检测周期在2～5分钟，大大缩短了内毒素检测的时间，检测速度快。

2、无需消耗检测试剂（鲎试剂），可大幅降低内毒素的检测成本。

3、检测方法简便，检测结果较为准确，可靠性高，适用于注射用水、注射剂半成品及成品中的内毒素含量测定。

具体实施方式

下面对本发明作进一步说明。

由于内毒素的结构一端是疏水的脂链，一端是亲水的糖链，类似表面活性剂的疏水端和亲水端。细菌内毒素在水溶液中以团聚的形式存在，团聚分子量在几千到百万的范围内，根据溶液的纳米胶粒子的特征，其粒径大小随浓度的增加而增大。纳米粒径分析仪是常用的检测粒径的仪器，而细菌内毒素分子团的粒径可以被粒径分析仪所检测是我们偶然发现的。

本发明方法具体包括如下步骤：

步骤1：采用参考标准、国际标准、国家标准或工作标准内毒素作为标准内毒素，确定所需的标准内毒素系列浓度，该系列浓度包括至少三个稀释浓度，制备系列浓度的内毒素标准溶液，采用纳米粒径分析仪对这些内毒素标准溶液进行粒径检测。

步骤2：对检测所得的粒径数据与相应内毒素标准溶液的浓度作回归分析，建立标准曲线ln(d)=k·C+b，该标准曲线的曲线评价系数需大于0.98，式中：d为粒径（单位：nm），C为内毒素浓度（单位：EU/ml），k为校正系数，b为修正系数。

步骤3：在相同条件下检测待测样品溶液中的内毒素粒径，根据标准曲线计算出待测样品中的内毒素含量。

下面提供本发明的一个实施例：

Ⅰ、细菌内毒素标准曲线的建立

设备材料：a、马尔文Nano ZS ZEW3600型激光粒径分析仪；b、细菌内毒素工作标准品（批号：150601-201070，规格：140EU·Amp^-1，中国药品生物制品检定所）；c、细菌内毒素检查用水（批号：100130，湛江博康海洋生物有限公司）。

方法步骤：取工作标准内毒素，使用检查用水配制成浓度为100EU/ml的内毒素标准溶液，再使用检查用水逐步稀释成系列浓度的内毒素标准溶液，系列浓度分别为50EU/ml、10EU/ml、1EU/ml、0.25EU/ml。