[发明专利]一种柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA提取方法，尤其是一种柑橘溃疡病菌的DNA水浴沉淀提取方法。

背景技术

柑橘溃疡病是由地毯草黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv. citri)引起的一种国内外检疫性病害，严重影响柑橘安全生产和对外贸易，被列入2007年公布的《中国人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。

该病害可通过带菌的种苗、接穗和果实等柑橘材料远距离传播，雪柑、甜橙、脐橙和四季柚等品种发生较为严重。引起该病害的病菌在叶、枝梢及果实的病斑中越冬，翌年春条件适宜时从病部溢出，借风雨、昆虫传播，经寄主的气孔、皮孔和伤口侵入。使叶片、嫩梢和果实发病，目前国内外除挖除病树烧毁外，尚无更好的根除办法。

目前柑橘溃疡病的检疫大多数以田间诊断为主，在一般情况下完全可凭肉眼判断，但症状不明显或未显现症状的带菌植株判断比较困难，易与其他病害混淆，同时由于黄单胞菌的种类及变种繁多，针对柑橘溃疡病的生化鉴定十分繁杂和困难。目前人们常用的柑橘溃疡病菌检测方法包括致病性、噬菌体检测法和血清学检测法等。随着分子生物学的发展，基于DNA的分子标记开始应用于不同病害的检测，由于该法直接以DNA的形式出现，可以较其他的田间诊断更为准确。因此，建立一种柑橘溃疡病菌DNA提取的方法，不仅能用于柑橘溃疡病菌的分子鉴定，还可以用于柑橘溃疡病菌基因的特异扩增，为其功能基因组研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供了一种可以快速抽提柑橘溃疡病菌的DNA的方法，以全面了解柑橘溃疡病菌的生物多样性，从而更好的为柑橘溃疡病的防控提供依据。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是按以下步骤进行：

(a) 将新鲜菌体加入洗涤缓冲液充分混合，使细菌细胞沉淀，弃上清液；

(b) 往步骤(a)制得的沉淀中加入裂解缓冲液，振荡悬浮，并于65 ℃水浴，完全反应；

(c) 加入65 ℃预热的抽提缓冲液，充分混合，加入等体积饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液抽提，离心使变性的蛋白沉淀，取上清液；

(d) 按照体积比为1:2的比例往步骤(c)制得的上清液中加入无水乙醇，﹣20℃放置待充分反应后，再高速离心至沉淀完全去上清液，加入体积浓度为70 %的乙醇洗涤沉淀，晾干后加入灭菌ddH₂O溶解沉淀，﹣20℃保存备用。

步骤(a)中，每0.12 g样品中加入洗涤缓冲液1 mL；所述洗涤缓冲液组成为：50 mmol/L Tris，即三羟甲基氨基甲烷，pH 7.7；25 mmol/L EDTA，即 乙二胺四乙酸；0.1 % PVP，即聚乙烯吡咯烷酮。

步骤(b)中，每0.12 g样品中加入裂解缓冲液50 μL；所述裂解缓冲液组成为：50 mmol/L Tris，pH 8.0；25 mmol/L EDTA；3.0 % SDS，即 十二烷基硫酸钠；1.2 % PVP。水浴时间5-10 min。

步骤(c)中，每0.12 g样品中加入抽提缓冲液400 μL；所述抽提缓冲液组成为：50 mmol/L Tris，pH 8.0；25 mmol/L EDTA；3.0 % SDS；1.2 % PVP。

步骤(c)中，饱和酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1。

本发明的效果是，本发明使用水浴法能够快速有效地提取到柑橘溃疡病菌的模板DNA，简捷快速。此外本法不需要特别的仪器，实验成本相对较低。使用本发明方法制备的DNA样品能够满足PCR方法对柑橘溃疡病菌进行分子诊断的需要。因此本发明建立了用水浴法快速抽提柑橘溃疡病菌的模板DNA的方法，为应用PCR技术进行早期诊断和预知检测提供基础和技术储备。

附图说明

图1：柑橘溃疡病菌DNA的琼脂糖凝胶电泳图。

图中，Marker从生物公司购买的DNA分子量标准(DL 2000 DNA ladder)，1、2分别代表平行样，数字为DNA的大小，单位为bp。

图2：PCR扩增柑橘溃疡病菌DNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图中，Marker从生物公司购买的DNA分子量标准 (100bp DNA ladder)，1、2分别代表柑橘溃疡病菌DNA的PCR产物平行样，数字为DNA的大小，单位为bp。

具体实施方式

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。