[发明专利]牛奶中土霉素残留ELISA检测方法

权利要求书

1.一种牛奶中土霉素残留ELISA检测方法，其特征在于通过以下步骤实现：

（1）土霉素免疫原和包被抗原的合成、鉴定

采用重氮法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O-tolidine）与牛血清白蛋白（BSA）偶联得到免疫原（OTC-tolidine-BSA）；再用相同方法将土霉素标准品通过同型双功能团试剂（O-tolidine）与卵清蛋白（OVA）偶联得到包被抗原（OTC-tolidine-OVA）；将BSA、OVA、OTC、O-tolidine和偶联产物，于波长190～400nm下进行紫外扫描鉴定；同时也对合成免疫原以及载体蛋白BSA做SDS-PAGE电泳实验进行鉴定；

（2）单克隆抗体的制备

取50～100μg 步骤（1）所得的免疫原与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀乳化，常规免疫方法免疫Balb/C小鼠，取出抗血清效价4000以上的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，具体操作依 ClonaCellTM-HY Hybridoma Cloning Kit说明进行；经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化，建立能稳定分泌抗OTC的杂交瘤细胞株，获得抗OTC单克隆抗体；

（3）OTC间接竞争性ELISA检测

1）包被抗原：①每孔加100μL1000×稀释的包被抗原OTC-OVA； 

②37℃孵育2h，后洗涤液洗涤2次，扣干；

2）封    闭：③每孔加入150μL的封闭液；

④37℃孵育2h，后洗涤液洗涤3次，扣干；

3）加    样：⑤每孔加入50μL待测样品，50μL1万×稀释的单抗；

⑥37℃孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；

4）酶标二抗：⑦每孔加入100μL5000×稀释的羊抗鼠IgG：HRP酶标二抗；

⑧37℃孵育30min，后洗涤液洗涤5次，扣干；

5）显色反应：⑨每孔加入100μL底物反应液，37℃避光反应20min；

6）终    止：⑩每孔加入50μL终止液终止反应，5min后测OD值。