[发明专利]区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种观察水稻纹枯病菌丝的方法，特别涉及一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，能应用于抗病品种的选育。

背景技术

立枯丝核菌（Rhizoctonia solani Kühn）属半知菌亚门真菌，所引起的水稻纹枯病是我国水稻的“三大”病害之一，这使得选育抗病品种显得异常重要。抗病品种的选育以病原菌与植物的互作机制为基础，利用显微镜观察病原菌在寄主植物细胞内菌丝生长发育以及形态变化是评价植物抗性的最直接的证据之一，而侵入寄主植物细胞内的菌丝不易染色，因而不利显微镜观察。

目前对立枯丝核菌和寄主植物的互作研究中，采用火棉粘贴法，但只可以观察到立枯丝核菌浸染结构的形成；采用的整叶染色透明法，只可以观察到菌丝体在寄主植物表面的生长情况，不能有效区分水稻叶鞘表面和内部的菌丝体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，该方法用卡拉唑黑E染料染色水稻纹枯病组织，利用荧光显微镜的荧光差异显示从而有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法，包括以下步骤：

1）、将直径为0.8~1.2mm的纹枯菌菌丝块接种到PDA培养基中进行培养，直至形成直径为1～2 mm的白色未成熟菌核（时间约为6~8天）；培养条件为：温度为27±1℃；暗培养；

2）、将步骤1）所得的白色未成熟菌核接种到水稻叶鞘内侧，直至水稻叶鞘的接种位点上出现病斑（时间约为3天）；培养条件为：16小时光照，光照强度45～60 μmol m-2.s-1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为27±1℃；上述光照和暗培养交替进行；相对湿度≥95%；

3）、割取上述长度为2～4cm含有病斑的水稻叶鞘，放入透明缓冲液中浸泡至水稻叶鞘脱色透明，并用卡拉唑黑E染料室温染色7~9 h（即放入卡拉唑黑E染料中于室温下浸泡7~9 h）；得染色叶鞘；

4）、将所述染色叶鞘进行荧光显微镜观察。

作为本发明的区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法的改进：步骤4）中的荧光显微镜观察为：荧光显微使用荧光滤片模块A（激发滤片BP340 nm – 380 nm，分光镜400 nm，发射滤片LP 425 nm）、I3（激发滤片BP450 nm – 490 nm，分光镜510 nm，发射滤片LP 515 nm）和N2.1（激发滤片BP515 nm – 560 nm，分光镜580 nm，发射滤片LP 590 nm）。

作为本发明的区分水稻组织内外纹枯病菌丝的染色和观察方法的进一步改进：步骤3）中：

透明缓冲液的制作方法为：将体积浓度为95%的乙醇溶液290~310 ml、氯仿145~155 ml、体积浓度为90%乳酸溶液120~130ml、苯酚145~155 g和水合氯醛440~460 g均匀混合；

步骤3）中的卡拉唑黑E染料的制作方法为：将0.9~1.1g卡拉唑黑E（Chlorazol black E, C1144, Sigma）溶解于1000 ml 的乳油中均匀混合；乳油由以下体积含量的成分组成：78~82%的乳酸以及相同体积含量的甘油和蒸馏水。

在本发明中，PDA培养基为常规培养基；其配方为：马铃薯 200 g/l+葡萄糖 20 g/l +琼脂 5 ~10 g/l，pH为7.0。

PDA培养基的制作方法具体如下：称取洗净去皮后的马铃薯200 g并切成小块，加水煮烂，用多层纱布过滤，在所得的滤液中加葡萄糖20 g和琼脂5 ~10 g，用蒸馏水定容至1L；均匀混合，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为7.0；于121℃灭菌20分钟左右，得PDA培养基。

依照本发明的方法，则可以利用荧光显微镜的荧光差异显示，叶鞘内部发红色荧光的菌丝体与在叶鞘表面呈黑色的菌丝体形成足够的反差，有效区分水稻叶鞘表面和内部的纹枯菌菌丝体。