[发明专利]正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物胚胎工程领域，具体地，涉及正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。 

背景技术

根据哺乳动物的卵母细胞是否分别在卵泡或输卵管中停留相对较长的时间而将其分成排卵前老化或排卵后老化，排卵后老化又可以根据卵母细胞所处的环境分为体内老化和体外老化。卵子体外老化是指哺乳动物卵子在体外培养一段时间后发生的一系列生化和表观遗传学变化。这些变化导致卵子受精率下降、受精胚胎发育和受胎率低、胎儿畸形率和出生后死亡率高等。它是制约哺乳动物胚胎工程效率的关键因素之一，目前国内外还没有延缓哺乳动物卵子体外老化的实质性技术。而研究报道，如：Kikuchi等首先发现卵子老化的可逆性，他们发现Caffeine与Vanadate通过控制MPF（成熟促进因子）的活性调控卵子老化，钒酸盐能加速卵子老化而咖啡因能延迟卵子老化。Goud等发现NO（一氧化氮）能够延迟卵子老化。DTT（二硫苏糖醇）能够提高受精率与胚胎细胞数、抑制碎裂、促进囊胚的发育，同时降低内细胞团细胞的碎裂。除此之外，TSA（曲古菌素A）能降低猪卵母细胞的碎裂与提高其发育能力，但是对于小鼠来说，TSA能够加速小鼠卵子的老化。在老化过程中卵子内发生大量的分子事件，例如，Ca²⁺离子稳态发生变化，活性氧（ROS）升高，能量和抗氧化物浓度降低，MPF和MAPK（促分裂素原活化蛋白激酶）活性降低。大量研究表明，Ca²⁺的异常变化可能是这些事件的核心因素。老化卵子Ca²⁺的异常主要表现为胞内游离Ca²⁺浓度增加，受精时Ca²⁺振荡幅度下降、持续时间缩短，这能直接引发卵子凋亡的发生和基因表观遗传的改化。近来 研究证明细胞老化影响T型钙离子通道，例如，与年轻的神经元相比，老年大鼠神经元的T型Ca²⁺通道密度会明显增加。 

因此，若能开发出通过抑制T型Ca²⁺通道，阻止卵胞质内游离Ca²⁺浓度升高而延缓卵子老化进程的技术，势必会对哺乳动物胚胎工程领域有很大的推动作用。 

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的是提供正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用。 

其中，所述正辛醇的浓度为：0.1~4mM。 

进一步地，所述正辛醇的浓度为：0.5~2mM。 

更进一步地，所述正辛醇的浓度为：1mM。 

其中，所述正辛醇在哺乳动物卵母细胞体外成熟培养后，开始出现老化，继续进行体外培养的阶段中加入。 

进一步地，所述哺乳动物卵母细胞体外成熟培养24h后，开始出现老化。 

其中，所述哺乳动物为牛，羊，猪，鼠等。 

其中，当所述哺乳动物为牛时，继续进行体外培养的阶段，所述正辛醇（1-octanol）添加在含有胎牛血清的培养液中。 

其中，所述胎牛血清的浓度为：5%~20%。 

进一步地，所述胎牛血清的浓度为：10%。 

本发明所述的正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用，包括：将牛卵巢经体外成熟培养后，放入含上述浓度的正辛醇的胎牛血清培养液中进行老化培养，然后分别进行孤雌激活和体外受精，进行体外培养，统计囊胚率。 

哺乳动物卵母细胞在体外成熟培养一段时间后开始老化，再转移到所述培养液中继续进行体外培养（上述老化培养），此时为了延缓哺乳动物卵子体外老化，加入所述正辛醇。一般情况下，哺乳动物卵 母细胞在体外成熟培养24h后开始老化。 

本发明提出通过抑制T型Ca²⁺通道，阻止卵胞质内游离Ca²⁺浓度升高而延缓卵子老化进程。本发明的发明人通过大量的实验研究，发现正辛醇与没有添加正辛醇的对照组相比，可以显著提高体外老化一段时间后哺乳动物卵子体外受精后的囊胚率。 

因此，本发明有益的技术效果如下： 

（1）应用方法简单、实用，只需在卵子体外培养液中添加一定浓度的抑制剂即可。 

（2）应用范围广，可以用于小型实验动物、家畜、灵长类的体外受精、细胞核移植、单精子注射等胚胎体外生产技术，也可以用于人的辅助生殖技术。 

（3）本发明的应用方法对卵子不产生化学毒害。