[发明专利]一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法

权利要求书

1.一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，包括：

（1）将拟穴青蟹分成感染组和对照组，感染组注射100μL副溶血弧菌，对照组注射100μL生理盐水，同时处理24h，分别在第0h，1h，3h，6h，24h取样；抽取拟穴青蟹血液，采用Trizal法提取血细胞总RNA，-80℃下保存；

（2）以候选基因序列为靶序列，β-肌动蛋白作为内参基因，设计多重基因表达引物，进行反转录反应和PCR反应，得到PCR产物；将PCR产物稀释，于GeXP表达分析系统中上样，测定候选基因的表达水平，即得到免疫刺激反应灵敏基因。

2.根据权利要求1所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于：所述步骤（1）中的副溶血弧菌的浓度为2×10⁶CFU/mL，生理盐水的浓度为0.9wt%。

3.根据权利要求1所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的候选基因及其多重基因表达引物分别为：

α巨球蛋白，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATACCGGATAAGGATGACCTCAA-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA GGTGTCCTTCACCGTCAACT-3’；

C-型凝集素，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATAAACTTTGTGATAATCGCCCG-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA CGACCTTCCACTTGTCCTGT-3’；

热激蛋白70，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATAAAGGACAAGGTGAGCGAAGA-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA TGCTCCAGTTCCTTCTGCTT-3’；

热激蛋白40，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATAGAGGAAGGGTGACATCATCG-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA TACCCACACTCCCTTTCTGG-3’；

类热激蛋白70因子，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATAATGCGAATGGTATCCTCCAG-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA TCCTGGACTCTACACGCTCC-3’；

硫氧还蛋白，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATAGTGGACGTGGATGAGAGTGA-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA TGATCCTGAGGGAAACCAAG-3’；

酚氧化酶原激活因子，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATATATCCTCAGACCTTCGCGTC-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA TTGTTGTCCAGGCAGATGAC-3’；

酚氧化酶原，

正向引物：5’-AGGTGACACTATAGAATAAGGTAGCACAGCCAGATGGT-3’，

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA CATTGGTGAAGGTGATGGTG-3’。

4.根据权利要求1所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的β-肌动蛋白的正向引物：

5’-AGGTGACACTATAGAATAGGTCGTACCACCGGTATTGT-3’；

反向引物：5’-GTACGACTCACTATAGGGA CTGGCCATCAGGAAGCTC-3’。

5.根据权利要求1所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的反转录反应的具体条件为：48℃1min，42℃60min，95℃5min。

6.根据权利要求1所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的PCR反应的具体条件为：95℃10min；94℃30s，55℃30s，70℃1min，35个循环。

7.根据权利要求1所述的一种筛选拟穴青蟹免疫刺激反应灵敏基因的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的上样运行步骤为：将稀释后的PCR产物和DNA分子量Marker混合物加入样本板，在与样本板对应的缓冲液板孔内加入3/4体积的缓冲液；进入Set Up程序，输入样品名，对每个样本指定Frag-3分离方法，指定默认的GeXP分析方法，开始运行程序。