[发明专利]星形孢菌素的制备方法

权利要求书

1.一种星形孢菌素的制备方法，所述的星形孢菌素的分子式为C₂₈H₂₆N₄O₃，结构式为其是通过发酵疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No.5213制备得到的。

2.权利要求1所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于发酵所述疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No.5213的培养基的组成为：可溶性淀粉2wt％，黄豆饼粉4wt％，MgSO₄ 0.075wt％、K₂HPO₄ 0.1wt％、FeSO₄·7H₂O 0.001wt％，余量为水。

3.权利要求2所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于发酵所述疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No.5213的发酵条件为：发酵温度28℃、转速200r/min，发酵时间5d。

4.权利要求3所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于发酵所述疮痂链霉菌许吕亚种CGMCC No.5213的最佳发酵条件为：初始pH 7.0，发酵温度28℃，种子液种龄48h，接种量6wt％，转速200r/min，发酵时间5d。

5.权利要求1-4任一项所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于还包括分离纯化步骤，并且其分离纯化步骤：发酵液经无水乙醇预处理后，采用乙酸乙酯萃取，萃取液通过硅胶柱层析和硅胶薄层层析，层析液再经高效液相。

6.权利要求5所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的乙酸乙酯萃取步骤是指将3倍体积的乙酸乙酯加入到浓缩10倍的预处理发酵液中，然后动态萃取2h，静止30min，收集有机相，反复萃取3次，合并有机相，减压蒸干得乙酸乙酯相，再用体积比为1∶1的氯仿和甲醇混合溶液溶解有机相得到所述萃取液。

7.权利要求6所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的硅胶柱层析步骤包括：取柱层用硅胶，用无离子水浸泡3h，抽干；再用浓HCl洗涤除去残留的铁和铝，然后用无离子水洗至中性，抽干，用无水乙醇浸泡过夜，抽干；120℃干燥至恒重；然后，采用石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脱，先用石油醚洗脱，然后逐渐增大氯仿的比例，最后增大到用甲醇把所有斑点洗脱下来，洗脱速度1.0mL/min，按洗脱梯度分管收集；以紫外吸收法和滤纸片法测定洗脱液抑菌活性；合并活性组分，减压浓缩，即得粗提品。

8.权利要求7所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的硅胶薄层层析步骤包括：薄板的制备：称取薄层层析用硅胶30g，羟甲基纤维素钠0.3g，加无离子水100mL，研磨均匀后，按照每块板约3g硅胶的量，均匀铺板，室温下自然风干，使用前置于烘箱中120℃活化30min，其中板的大小为5cm×20cm；展层剂为氯仿和甲醇，氯仿和甲醇的体积比为10∶1；将上述所得的粗提品溶于体积比为1∶1氯仿和甲醇的溶液样品，沿横线均匀点在薄板上，横线距薄板底端的距离为1.5cm，点样量约50μL，上行展层；展层完毕后，将薄板取出，自然风干，置于紫外光照箱中观察、照相，用铅笔在薄板上标出所显示的带谱，利用生物活性测定找到活性带谱；用无菌水将指示菌枣青霉病菌制成孢子悬液，待熔化的PDA培养基放置至45℃左右时混入其中，定量倒入平板，凝固后，将展层完毕后并经紫外线灭菌薄板轻轻反扣在平板上，轻轻压平，静置45min，取下毒板，置25℃恒温培养箱培养48h，观察活性组分的出现情况并测定Rf值。

9.权利要求8所述的星形孢菌素的制备方法，其特征在于所述的高效液相色谱纯化步骤包括：取硅胶薄层样品充分溶于甲醇中，用0.45μm微孔过滤器过滤，自动进样器进样，每次进样量为1.5mL；以100％甲醇为流动相，3.5mL/min的泵流速进行循环分离，利用UV检测器在波长291nm处检测所对应的洗脱液并进行活性检测，将所得样品真空浓缩干燥得到星形孢菌素。