[发明专利]一种用于分离纯化凝血因子VIII的介质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于分离纯化凝血因子VIII的介质及其制备方法，属于生物分离材料领域。具体地说涉及一种用于以亲和层析色谱或扩展床吸附法从血液、血清、血浆、血浆组分、细胞培养液、细胞均化液等生物原料中分离纯化凝血因子VIII的新型生物分离材料及其制备方法。

发明背景

生物分离介质是专门用于提纯和精制生物相关产品的一类材料。分离介质广泛用于医药行业、发酵行业、生物制品、血液制品、疫苗和基因工程产品分离。在纯化产品时，分离介质具有分离效果好、产品纯度高、使用范围广，而且还具有可以进行大规模连续自动化生产的特点，使之成为目前对高纯度和高附加值产品进行分离的首选方法。依赖分离介质的产品涵盖基因重组药物、抗体、疫苗、诊断试剂、生化产品、血液净化、基因芯片以及抗生素等。

凝血因子是参与血液凝固过程的各种蛋白质组分。它的生理作用是，在血管出血时被激活，和血小板粘连在一起并且补塞血管上的漏口。这个过程被称为凝血。凝血因子VIII基因位于X染色体长臂末端(Xq28)，长为186kb，由26个外显子组成，其中第14号外显子为3.1kb，是目前发现的人类最大的外显子之一。凝血因子VIII mRNA长9kb，编码一条由2351氨基酸组成的前体多肽.去除N端19个残基的个信号肽后，成熟蛋自由2332氨基酸组成.氨基酸顺序分析表明，凝血因子VIII蛋白由3个A结构域，一个B结构域及2个C结构域组成。各区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2，从血浆中及从重组细胞培养上清中分离纯化得到的凝血因子VIII是由两条肽链所组成，重链由A1-A2-B或A1-A2组成，分子量为90～200kDa不等；轻链由A3-C1-C2所组成，分子量为80kDa，二条肽链间由Ca2+连接。目前的研究表明，B结构域对凝血因子VIII的凝血活性并非必需。

凝血因子VIII为血友病病人的救命药。然而，不论是以血浆为原料的凝血因子VIII生产法还是以表达基因重组凝血因子VIII细胞为原料的生产法，由于目前生产过程复杂，并且全部使用十分昂贵的抗体，即采用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析技术以纯化凝血因子VIII，致使其价格居高不下，且存在很多安全隐患(Clonis YD，Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop.J Chromatogr A.2006，1101(1-2)：1-24；Lowe CR，Lowe AR，Gupta G.，New developments in affinity chromatography with potential application in the production of biopharmaceuticals.J Biochem Biophys Methods.2001，49(1-3)：561-74)。尤其在中国，基因重组凝血因子VIII生产法技术迟迟未过关(拜耳属于进口技术除外)，而血浆制品市场来源有限，长期供应紧张，中国又限制血液制品进口，致使凝血因子VIII产品不但价格奇贵，而且总是缺货、断货。总体来说，全球凝血因子VIII药品目前主要的开发方向是，优化凝血因子VIII分离效率、纯化效率与生物比活性的方法，以便在保障其安全性的前提下，降低其生产成本。其中一个主要目标是研发替代生产用小鼠源单克隆抗体亲和柱层析的纯化技术。小鼠源单克隆抗体亲和柱层析纯化法除成本高外，另有其它潜在问题或风险：例如，抗体或其片断在产品洗脱过程中受到某些不利的作用(酸碱、高温、蛋白酶等)会从固定相脱落，或形成碎片、进入流动相、进入人体，或是凝血因子活性降低，或带来潜在免疫原或由该抗体生产过程所带来的病毒以及未知病原体等(Mejan O，Fert V，Delezay M，Delaage M，Cheballah R，Bourgois A.，Immunopurification of human factor VIII/vWF complex from plasma.Thromb Haemost.1988，59(3)：364-71；Gomperts E，Lundblad R，Adamson R.，The manufacturing process of recombinant factor VIII，recombinate.，Transfus Med Rev.1992，6(4)：247-51)。寻找可以替代上述抗体的小分子，是世界众多生物制药科学家及同行的重要课题。因此，本发明主要是设计选择性更好的小肽亲和配体，固定在亲水凝胶微球的表面，特异性地吸附凝血因子VIII，更有效地实现凝血因子VIII的分离纯化。