[发明专利]定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。

背景技术

大肠杆菌（Escherichia coli)是一种食源性致病菌，会引起腹泻、恶心、出血性结肠炎等症状。近年来，由大肠杆菌引发的感染性疾病在许多国家都相继报道，已经成为世界性的环境安全性问题。

目前，大肠杆菌的传统检测方法是培养法。然而，近年的研究发现，细菌在环境压力（如高温）下可以进入“具有活性但不可培养（viable but nonculturable，VBNC）”的状态，无法用常规培养法检出，但仍然保持代谢活性和致病性，能够在环境压力解除的条件下恢复其可培养性，引发严重的微生物安全风险。已经有研究表明，大多数革兰氏阴性菌（包括大肠杆菌）也可以进入这样的状态。因此，传统培养法无法检测到处于VBNC状态的大肠杆菌而得到假阴性的结果。

PCR技术可以快速、灵敏的检测到目标菌。然而有研究表明，经过热处理后，尽管细菌已经丧失细胞活性，但作为PCR扩增模板的DNA仍可以存在数天，因此常规PCR技术无法区分活性菌与非活性菌。

与DNA相比，大多数mRNA较不稳定，其半衰期较短（仅几分钟），可以更好的作为活性菌存在的分子信标。已有大量研究证实，细菌体内mRNA的存在与其细胞活性之间存在显著关系。又有研究表明，处于VBNC状态的细菌仍具有转录活性，其体内仍可以检测到一定量的mRNA。

实时荧光定量PCR和反转录（又称逆转录）为定量检测样品中的RNA提供了技术手段。有研究者使用基因组DNA或者质粒DNA片段作为反转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测实际样品中RNA的标准品。可是，使用DNA作为标准品并没有考虑到反转录中的效率问题，从而导致检测到的RNA与实际相比减少了84%-98.6%。因此，以DNA作为检测RNA的标准品会大大低估样品中实际的RNA的含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量检测大肠杆菌RNA的方法及其专用标准品和应用。

本发明提供了一种定量检测大肠杆菌RNA的方法，包括如下步骤：

（1）按照如下方法制作标准曲线；将RNA标准品配制成各个浓度的标准品稀释液，然后将各个标准品稀释液反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，以实时荧光定量PCR体系中的cDNA对应的RNA拷贝数（也可对拷贝数进行数据处理，如拷贝数以10为底的对数）和Ct值制作标准曲线方程；

（2）提取大肠杆菌的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，将Ct值代入所述标准曲线方程，得到大肠杆菌的RNA含量。

所述RNA标准品可为所述大肠杆菌的部分核酸片段。

所述步骤（1）的所述实时荧光PCR和所述步骤（2）中的所述实时荧光PCR的反应体系和反应条件均可相同。

所述RNA标准品具体可为序列表的序列6所示的单链RNA分子。

所述实时荧光PCR采用的引物对具体可为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

所述标准曲线具体为一元线性回归曲线。

所述实时荧光定量PCR的退火温度具体可为55.5°C。

以上任意所述方法均可应用于检测大肠杆菌活菌数（一个拷贝数的RNA可以代表一个活菌）。

所述检测大肠杆菌活菌数具体可为检测水样中的大肠杆菌活菌数。

本发明还保护序列表的序列6所示的单链RNA分子。

本发明还保护序列表的序列1所示的双链DNA分子。

本发明还保护定量检测大肠杆菌RNA的特异引物对，由序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成。

本发明还保护一种定量检测大肠杆菌RNA（或检测大肠杆菌活菌数）的试剂盒，包括标准品和特异引物对；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。

本发明还保护标准品和/或特异引物对在制备定量检测大肠杆菌RNA的试剂盒（或制备检测大肠杆菌活菌数的试剂盒）中的应用；所述标准品为序列表的序列6所示的单链RNA分子；所述特异引物对为序列表的序列4所示DNA片段和序列表的序列5所示DNA片段组成的引物对。