[发明专利]一种猪流感病毒毒株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物病毒领域，涉及病毒新毒种，具体涉及一种猪流感病毒毒株及其生物学特性。

背景技术

2010年10月，漯河市某猪场猪群7头1月龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为流鼻涕，发烧和咳嗽。采集发病猪的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24h内送至实验室。鼻拭子进行漩涡震荡高速离心处理，取上清接种10日龄鸡胚尿囊腔接种。结果分离到一株有血凝性的疑似流感病毒，经分子鉴定后确定其为H1N2猪流感病毒。

发明内容

本发明本发明的目的是提供一种猪流感病毒毒株，分类命名：猪流感病毒，拉丁文学名：swine influenza virus，简称SIV，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC，保藏单位地址：武汉市武汉大学，保藏日期：2012年5月15日，保藏编号CCTCC NO：V201223。

本发明的技术方案是：一种猪流感病毒毒株，猪流感病毒（swine influenza virus），CCTCC NO：V201223。

所述的猪流感病毒毒株具有下述特点：

（1）所述毒株的核酸类型是单股负链RNA病毒，由大小不等的8个独立节段组成，分别是：PB2基因片段长度为2341 bp，PB1为2341 bp，PA为2233 bp，HA为1777 bp，NP为1565 bp，NA为1466 bp，M为1027 bp，NS为890 bp。  

（2）所述毒株对脂溶剂乙醚、氯仿和酸敏感；属于热稳定型毒株；血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。

（3）对鸡胚的致病力较弱，其中EID₅₀  为10^-5.86 ，ELD₅₀为10^-2.43；能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变；小鼠感染试验中未观察到明显临床症状，感染后14天能从小鼠血液中检测到抗体。

（4）利用通用引物对所述毒株进行PCR鉴定后，再进行全基因组PCR扩增并克隆测序，用philip3.64分析软件结果显示该毒株为新型四源重组病毒，其中HA、NP和NS片段来源于经典猪流感；NA和PB1片段来源于类人H3N2流感病毒；PB2推测来源于美洲禽流感；M基因来源于欧洲禽流感。

所述的猪流感病毒毒株在制备疫苗的生产毒种中的应用。

本发明的有益效果是：本发明的H1N2猪流感病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的的保护，可应用在制备疫苗的生产毒种。

附图说明

图1为SIV通用引物电泳图；

图2为亚型引物PCR产物电泳图；M：DNA质量分子标准；1-3：SIV通用引物RT-PCR阳性样品；P：阳性对照；N：阴性对照

图3为SIV全基因组PCR产物电泳图；Mark：DNA质量分子标准；1-8：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因片段。

具体实施方式

2010年10月，漯河市某猪场7头1月龄猪只发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为流鼻涕，发烧和咳嗽，其发病表现与国内报道的其他地区发病的猪流感症状大致相似，初步判断为猪流感。 

采集发病猪的鼻拭子，并立即保存于含抗生素的DMEM培养液中，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。鼻拭子进行漩涡震荡高速离心处理，取上清接种10日龄鸡胚尿囊腔接种。结果分离到一株有血凝性的疑似流感病毒，血凝试验排除鸡新城疫和禽减蛋综合征病毒。第3代尿囊液进行有限稀释克隆后其最高血凝价7log2；用特异性引物进行分子鉴定后确定其为H1N2猪流感病毒。

理化特性试验表明所述毒株经过氯仿、乙醚和酸处理后，不能再感染鸡胚，判断其对脂溶剂敏感。病毒属于热稳定型毒株；血凝谱较广，能凝集鸡、猪、豚鼠、兔、小鼠、绵羊和牛的红细胞。

该病毒对鸡胚的致病力较弱，其中EID₅₀  为10^-5.86 ，ELD₅₀为10^-2.43；能够感染MDCK细胞，造成细胞拉网脱落等病变；小鼠未观察到明显临床症状，感染后14天能从小鼠血液中检测到抗体。