[发明专利]一类绿光荧光菁染料、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及精细化工领域中一类新的荧光染料、制备方法及其应用，特别是涉及一类单电荷含氮菁类荧光染料、其制备方法，以及利用该荧光染料、其缀合物或其组合物在生物方面的应用。

背景技术

DNA（脱氧核糖核酸）是一类带有遗传信息的生物大分子。生物体正常细胞均具有比较稳定的DNA二倍体含量，只有当发生癌变或具有恶性潜能的癌前病变时，才伴随细胞DNA含量的异常改变。因此对DNA的特异性识别和精确测量，尤其是在活细胞内的检测，在癌症的早期诊断中意义非常重大。利用荧光技术进行DNA的定量分析具有灵敏度高、响应快、仪器使用便捷等优点引起广大科研工作者的兴趣。目前，商品化的此类染料主要有菲啶类(EB、PI)、吖啶类(AO)、咪唑类(Hoechst、DAPI)和花菁家族类(Cy、TOTO、SYTO)等。然而，这些染料都各自存在着应用的局限性。其一，较大一部分染料与DNA结合后呈现荧光淬灭，如10,10’-二乙基-2,2’-二磺基-9,9’-双吖啶、藏红T、耐而蓝、甲基蓝等淬灭型DNA探针虽然报道检出限最低可达ng/mL级，但淬灭的荧光信号在荧光成像等可视化应用中实用价值不高。其二，有相当一部分荧光染料的激发光处在紫外光区，如能够专一识别脱氧核糖核酸(DNA)的荧光染料DAPI、Hoechst 33258，Hoechst 34580等，在紫外光激发下与DNA结合产生蓝色荧光。由于紫外光对细胞内的核酸、蛋白等组分会造成严重的损伤，因此这类荧光在荧光显微技术中的使用受到光激发时间的限制[Davis SK,Bardeen C,J.Photochem Photobiol2003;77:675–679]。此外，在紫外区进行荧光检测时，生物样品在这个区间的吸收使光进入生物组织内部变得困难，同时生物样品中某些成分的自发荧光形成很强的背景干扰，使检测效率大大降。其三，有相当一部分染料应用受限于固定细胞，如TOPRO、TOTO家族染料、溴乙锭(EB)、碘化丙啶(PI)等需要通过增大细胞膜的通透性或类似使膜崩解的方法才能对生物样品进行有效的荧光标记。然而，这种固定方法往往对细胞和生物组织真实形态的观察有负面影响[Kozubek S,Lukasova E,Amrichova J,Kozubek M,Liskova A,Slotova J.Anal Biochem2000;282:29-38]。同时，溴乙锭等吖啶，菲啶类染料有很大的毒性和致癌性。Invitrogen公司开发了可在溶液中定量超灵敏检测dsDNA的试剂盒Quant-iT PicoGreen（Ex/Em=502/523nm，检测范围：0.2-100ng/mL），但该染料结构尚不明确，价格也非常昂贵。因此，开发可同时满足激发和发射波长良好，对DNA有特异性并定量检测、及活细胞通透性的荧光探针是一项极具挑战性的工作。