[发明专利]鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液。

背景技术

自从1969年日本学者千原首次报道香菇多糖具有抗肿瘤活性以后，真菌多糖引起越来越多的关注，成为一个非常活跃的研究领域。药用真菌多糖被称为生物反应调节物(Biological response modifier，BRM)，因其具有广泛的生物学活性如免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、降血糖、抗衰老、抗氧化、抗病毒等作用。鸡枞菌多糖具有易溶于水不溶于乙醇的特性，可通过水提醇沉的方法获得。但这些多糖含有较多杂质，如游离蛋白质、色素以及一些低分子物质，包括寡糖、一些单搪、盐分等，因此必须将粗提多糖进行纯化并鉴定其纯度，为下一步的研究做准备。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种鸡枞菌多糖分离纯化方法及其注射液。

本发明的技术方案如下：

一种鸡枞菌多糖分离纯化方法，采用超声波法提取，20kHz的超声功率，在80℃、料液比为1∶20、提取40min，共提取2次得多糖粗提物，将多糖粗提物配成浓度为20％的溶液，-20℃冷冻，室温缓慢融化，3000r/min离心10min，除去聚沉物；重复冻融5次；将经过冻融的多糖溶液与Sevage试剂按4∶1比例混合，充分振荡30分钟，2000r/min离心10min，下层白色絮状沉淀为蛋白质层，收集上层多糖溶液；重复上述步骤3次；向除蛋白后的多糖溶液中加入氨水，调pH值到9，50℃保温，不停搅拌，边搅拌边加入10％H₂O₂直至溶液呈浅色为止；将脱色后的多糖溶液装入透析袋，透析袋的截留分子量＞8000，以蒸馏水流水透析24小时，40℃减压浓缩至100mL，加入3倍体积的无水乙醇后静置3h，3000r/min离心10min，将沉淀于40℃鼓风干燥后称重。

鸡枞菌多糖注射液，将精制鸡枞菌多糖以生理盐水配制为20mg/mL的多糖溶液，调pH＝7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，无菌条件下分装，4℃保存。

本试验结合畜禽生产实践将TAP注射液结合疫苗使用，以免疫动物的抗体消长规律、白细胞总数及分类计数、免疫器官指数等指标的变化综合考察了不同剂量TAP的免疫增强效果，结果表明一定剂量TAP可显著提高试验动物的体液免疫及细胞免疫能力，效果优于同剂量的APS。

附图说明

图1提取温度对TAP粗多糖含量的影响；

图2提取液料比对TAP粗多糖含量的影响；

图3提取时间对TAP粗多糖含量的影响；

图4提取次数对TAP粗多糖含量的影响；

图5两种提取方法对TAP粗多糖含量的影响；

图6葡萄糖标准曲线；

图7为TAP对口蹄疫抗体的影响(n＝6)；注：相同时间的柱形图上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P＜0.05)，标不同字母表示差异极显著(P＜0.01)；

图8为TAP对新城疫抗体的影响(n＝10)；注：相同时间的柱形图上标不同大小写的同一字母表示差异显著(P＜0.05)，标不同字母表示差异极显著(P＜0.01)。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1鸡枞菌多糖分离纯化工艺研究

1试验材料

1.1主要药品与试剂

鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)子实体干品购自西昌市凉山山珍销售处，重蒸苯酚，透析袋(截留分子量8000～14000)，胰蛋白酶，葡萄糖，浓硫酸，氢氧化钠，无水乙醇，氯仿，正丁醇，过氧化氢等为国产分析纯。

1.2主要仪器

DU800紫外可见分光光度计(BeckmanCoulter，Inc)，AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)，格兰仕微波炉(格兰仕电器有限公司)，超声波清洗机(泰能设备有限公司)，RE52-99型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，Fw177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)，SW-420-2S型恒温水箱(金坛市新航仪器厂)，CSIO1-IE电热鼓风干燥箱(中外合资重庆四达试验仪器有限公司)，MYIO电磁搅拌器(上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司)等。

2方法

2.1鸡枞菌粗多糖提取工艺的单因素研究

2.1.1温度对粗多糖得率的影响