[发明专利]用于成像式荧光显微术的显微镜及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于成像式荧光显微术，特别是用于宽视野荧光显微术的显微镜，其具有脉冲式光源和成像探测器。此外，本发明还涉及一种特别是应用本发明的显微镜的相应方法。

本发明总体涉及荧光显微术，其中特别是涉及宽视野荧光显微术。

背景技术

宽视野荧光显微术在生物和医学研究中具有重大意义。在传统的荧光显微术中试样或多或少经逐点照射，而在所谓的宽视野显微术(widefiled-microscopy)中所述试样经大面积照射，并用物镜成像，以致该整个系统的PSF(点扩展函数，Point Spread Function)仅由物镜的(探测)PSF决定。与此相反，在共聚焦显微镜中入射光聚焦在试样上，以致该总PSF是照射PSF和探测PSF的乘积。

较之在具有空间滤光片的共聚焦显微镜中通过探测针孔所能实现的，原则上，在宽视野荧光显微镜中有明显更多的激发光从试样反散射进显微镜的探测器的光径。然而为了能够在令人满意的条件下摄取图像，必须充分抑制散射光/反射光。为此，在宽视野荧光显微镜中通常使用抑制该相应激发波长的吸收滤光片。这通常借助于滤光立方体实现，所述滤光立方体除包含吸收滤光片(发射滤光片)外还包含用于激发光的光谱纯化的激发滤光片和作为主分光片的二向色镜，其中所述主分光片同时有助于激发滤光片和发射滤光片。

但对此的缺点是，由于不变的滤光片特性，激发光的光谱调谐是不可能的。此外，在多波长激发时，必需使用在合适的光谱位置上进行透射或反射的完全特定的滤光片，这进一步限制了滤光片的灵活性，并在许多可能的光谱激发范围和探测范围里需要进行大量的滤光片组合，以至于这是不可能通过在实践中常用的滤光片轮实现的。此外，各滤光片的光谱宽度还有所制约，即该探测范围距激发波长范围必然有一定的光谱间距，从而在中间范围损失了探测光，对于显微镜更高的灵敏度来说，该探测光是应该可以探测到的。

对共聚焦显微镜可示例性地参阅文献DE 199 06 757 A1。其中该探测光通常至少部分作为被校准的光束而穿过针孔。相应地可使用声光部件。与此相反，在宽视野显微镜中，在视野镜组中存在真实图像，这表明光在许多可能的空间角度中同时入射，这使得相应的声光部件的使用似乎反而没什么意义，甚至完全不可能。这归因于所述声光部件需要极大的光孔，因此会特别复杂且昂贵。

在文献US 5252834中公开了显微镜中的门控制，但不用于成像和完全不适用成像中的反射光抑制/散射光抑制。但其中涉及逐点光谱摄像试样的化学组成的特性测定(显微分光光度术)。其中未提供成像探测器。

发明内容

本发明的目的在于，在适用于宽视野荧光显微术的成像式荧光显微镜中，利用简单的装置实现反射光抑制/散射光抑制，用以因此在令人满意的条件下摄取可再现的图像。对此所需的措施应可用简单的装置成本低廉地实现。

上述关于本发明的显微镜的目的是通过权利要求1的特征部分实现的。上述关于本发明的方法的目的是通过从属权利要求18的特征部分实现的，更确切地说是利用本发明的显微镜。

关于本发明的显微镜，其基本目的是如此实现的，即设有用于门控制的装置，并通过该门控制实现光源和探测器的同步以达到反射光抑制/散射光抑制的目的，从而对适宜于处理的荧光成分加以利用，而对不适宜的成分予以舍弃。本发明的方法是相应地为此设计的。

本发明的方法提出对显微镜中的成像探测器结合脉冲光源进行门控制。然而目前在显微术中主要使用的照相机不允许进行门控制，甚至不对所有像素同时进行，因为通常是通过共同的读取寄存器进行按序读取。通常也不允许使用具有单光子灵敏度的CMOS芯片，因为尽管可以利用其进行并行读取，但该读取过程在亚100ns范围内对适用的门控制来说实在是太慢了。

基于本发明，优选将以盖革模式运行的雪崩光电二极管的阵列(APD阵列；其中这种APD有时也被称为“硅光电倍增管”)用于成像设备，所述成像设备允许进行门控制的，并可借助它实现本发明的反射光抑制/散射光抑制。原则上也可以考虑其它适于“可门控制的照相机”的可能性。

本发明基于利用脉冲光源和成像探测器进行工作的荧光显微镜。考虑到荧光的衰变时间，当脉冲光源所具有的脉冲宽度在荧光团的寿命范围内或更好地低于此范围时，对于脉冲光源是有利的。基于通常的荧光染料，脉冲宽度在5ns范围内，优选在1ns范围内，更优选在200ps范围内是有利的。光源可以是激光器、LED、闪光LED或可被激发激光的放大介质等。如果该光源可触发则更是特别有利的，其中这一点对于本发明技术方案的实施不是必不可少的。