[发明专利]一种体外生产牦牛胚胎的方法

权利要求书

1.一种体外生产牦牛胚胎的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将采集的牦牛卵巢0-3h内用生理盐水30-38℃带回实验室，用抽吸法获取卵母细胞置于保存液中；

(2)将卵母细胞用成熟液洗涤3次，培养27-28h；

(3)牦牛冷冻精液用改良的BO液上浮法处理；

(4)步骤(3)处理的精子移入受精液中，受精液中含步骤(2)处理的卵母细胞；

(5)受精16-18h后，用0.2％透明质酸酶溶解卵丘细胞1-2min，然后Voatex漩涡震荡，脱除卵丘细胞；

(6)将步骤(5)处理的受精卵移入颗粒细胞共培养体系中，每隔48h换1/2体积的培养液，培养144-168h后收集牦牛胚胎。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体外生产牦牛胚胎的技术参数为：CO₂含量5％；温度38.5℃；湿度饱和。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的保存液为PBS液添加聚乙烯醇0.4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中卵母细胞成熟液基础液为Medium199，并添加丙酮酸钠0.2mmol/L，胎牛血清10％，促黄体素5mg/L，促卵泡素0.5mg/L，雌二醇1mg/L。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中上浮法步骤为：将1-4支牦牛冷冻精液细管于38℃水浴解冻，解冻后的精液加入盛有1.0-1.5mL BO获能液的离心管底部，在CO₂培养箱中倾斜30-45°放置，使精子上浮；上浮1h后，吸取上清液0.5-1.2mL，用洗精液离心洗涤两次，再用获能液上浮25-35min；所述获能液由BO基础液添加3.108g/L碳酸氢钠、0.138g/L丙酮酸钠、10mM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白组成；所述BO基础液由112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、0.83mM磷酸二氢钠、0.52mM氯化镁、2.25mM氯化钙、13.9mM葡萄糖及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述CO₂培养箱中：CO₂含量5％；温度38.5℃；湿度饱和。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，受精液由BO基础液添加3.108g/L碳酸氢钠、0.138g丙酮酸钠、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素组成。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，培养液为基础液M199添加10％胎牛血清；颗粒细胞共培养体系制备方法：采集完卵母细胞后，取检卵平皿中剩余的含颗粒细胞的卵泡液1mL，加2mL0.2％透明质酸酶消化3-5min，用等量培养液终止消化后，200g离心5min，沉淀用5mL培养液再次悬浮，200g离心5min，最终的沉淀用培养液悬浮，用移液器将悬浮液加入培养液滴中，其最终浓度为10⁶个/mL。