[发明专利]应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法和装置

权利要求书

1.一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染的装置，其特征在于包括培养皿和培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，基板上设置有贯通柱孔，所述贯通柱孔至少下端伸出基板并保证其下端底部与培养皿底距离为1mm～2mm；所述贯通柱孔的孔内径大小与外植体茎径大小相适配。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于包括培养皿和培养皿盖，在培养皿中固定有一基板，所述基板为用于核苷酸片段扩增的PCR板；切掉PCR板底部的小管形成贯通柱孔，保留PCR板四个角上的小管作为支架，置于培养皿中。

3.一种应用于大豆下胚轴外植体转化受体系统的农杆菌局部侵染方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）制备用于局部侵染处理下胚轴外植体的农杆菌菌液；

（2）获取大豆下胚轴外植体供体材料和下胚轴外植体；

（3）将下胚轴外植体插入权利要求1或2所述装置的贯通柱孔中，使下胚轴外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，权利要求1或2所述装置的培养皿中倒入BA处理溶液至1mm～2mm深度，盖上培养皿盖，静置20min后倒掉BA溶液；

（4）对经步骤（3）处理的下胚轴外植体进行农杆菌侵染前的预培养；

（5）将经过步骤（4）预培养后的下胚轴外植体插入权利要求1或2所述装置的贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，权利要求1或2所述装置的培养皿中倒入步骤（1）所述的农杆菌菌液至1mm～2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉农杆菌菌液；

（6）对侵染后的下胚轴外植体进行共培养；

（7）对侵染后的下胚轴外植体进行恢复再生培养；

（8）对侵染后的下胚轴外植体再生的不定芽进行筛选培养；

（9）抗性芽生根培养与抗性苗驯化移栽；

其中，步骤（4）所述预培养为1～2天；步骤（6）所述共培养为3～6天。

4.根据权利要求3所述的侵染方法，其特征在于步骤（4）所述预培养为1天。

5.根据权利要求3所述的侵染方法，其特征在于步骤（6）所述共培养为3天。

6.根据权利要求3所述的侵染方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）用已灭菌的接种环蘸取EHA 105农杆菌菌种菌液，在固体培养基上划线接种之后，培养至长出单菌落，再用接种针挑取单菌落接种至盛有液体农杆菌培养基的大离心管中，恒温摇床培养，离心，保留沉淀，再向大离心管沉淀中加入液体共培养基，悬浮沉淀，恒温摇床培养，调整菌液的OD值为0.5～1.0；

（2）大豆种子经灭菌后接种至无激素MSB5培养基上培养，获得大豆幼苗作为下胚轴外植体供体材料，从幼苗切割下胚轴切段为外植体；

（3）把切割好的下胚轴外植体插入权利要求1或2所述装置的贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，然后所述装置的培养皿中倒入BA处理溶液至1mm～2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉BA溶液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的BA溶液；

（4）把经过步骤（3）BA溶液处理后的外植体以竖插方式接种至无激素MSB5培养基上，预培养；

（5）把经过步骤（4）预培养后的下胚轴外植体插入权利要求1或2所述装置的贯通柱孔中，使外植体的形态学上端朝下接触培养皿底，然后向所述装置的培养皿中倒入步骤（1）所述的农杆菌菌液至1mm～2mm深度，盖上培养皿盖，静置20 min后倒掉农杆菌菌液，取出下胚轴外植体，放置在无菌吸水纸上，吸去外植体表面残留的农杆菌菌液；

（6）把经过步骤（5）农杆菌局部侵染后的下胚轴外植体以外植体的形态学上端朝上的竖插方式接种至无抗生素的固体共培养基上共培养；

（7）把经过步骤（6）共培养后的下胚轴外植体以外植体的形态学上端朝上的竖插方式接种至无抗生素的恢复培养基上培养；

（8）把经过步骤（7）所述恢复培养后已经再生不定芽的下胚轴外植体以横放方式接种至筛选培养基上培养；

（9）把经过步骤（8）筛选培养后仍然鲜绿的抗性芽从外植体上切割分离1cm～2cm，以竖插方式接种至生根培养基上培养，取出生根的抗性苗，洗净抗性苗根上的培养基后，栽植到干净的细砂基质中保湿炼苗。