[发明专利]加强表达转运蛋白LysE提高钝齿棒杆菌L-精氨酸的产量

说明书

技术领域

本发明涉及通过加强lysE基因在钝齿棒杆菌的表达提高L-精氨酸产量，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸，是合成蛋白质肌酸的重要原料，也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物，具有多种独特的生理和药理作用。L-精氨酸在临床医药、食品、化妆品以及有关生物研究领域中用途广泛。发酵法是目前L-精氨酸商业化生产比较有效和经济的方法。

增加合成途径中酶的表达量是提高L-精氨酸合成途径的代谢通量最终提高其产量最重要的策略之一，这也是代谢工程育种的主要手段，但研究发现，微生物细胞内氨基酸合成的通量增加会导致细胞内产物的积累量远高于野生型菌株，这表明改造后的菌株虽然一定程度上增加了目的产物的产量但产物的转运能力却是有限的。降低胞内产物L-精氨酸浓度解除其合成代谢途径中关键酶的反馈抑制和反馈阻遏有利于进一步提高L-精氨酸合成途径的代谢通量实现L-精氨酸的过量生产。

在细菌中，氨基酸转运系统成分非常复杂，它由许多具有特定结构和功能的转运蛋白家族成员组成。在诸多氨基酸转运蛋白中，来源于谷氨酸棒杆菌的L-赖氨酸转运蛋白LysE的研究最多，1996年，Vrljic等人成功克隆了L-赖氨酸转运蛋白基因lysE，该基因的产物LysE由236个氨基酸构成，分子量约为25kD，其结构和功能都很新颖。2001年，德国学者L.Eggeling等人通过引物延伸及融合表达等实验证明位于L-赖氨酸转运蛋白基因lysE上游的lysG基因是其转录的正调控基因，并找出了lysE基因转录的起始位点。他们还发现，尽管L-赖氨酸转运蛋白对L-精氨酸表现出较弱的亲和力(Km≈20mM)，但L-赖氨酸转运蛋白LysE几乎以相同的速率从细胞内向细胞外转运L-赖氨酸和L-精氨酸。

综上所述，转运蛋白LysE在降低胞内L-精氨酸浓度解除其合成代谢途径中关键酶的反馈抑制和反馈阻遏，进一步提高其产量发挥重要作用，研究lysE基因编码的转运蛋白LysE对实现精氨酸的过量生产有着非常重要的生产指导意义。

针对L-精氨酸发酵中代谢通量的增加引起胞内产物浓度的过度积累，抑制L-精氨酸产量进一步提高的问题，本发明首次以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5为研究菌株，通过加强lysE基因在钝齿棒杆菌的表达降低L-精氨酸的胞内浓度，以解决包内产物积累引起的反馈阻遏及反馈抑制问题。C.crenatum SYPW是本实验室筛选得到的高产精氨酸突变菌株(菌株的保藏编号为CCTCC NO：M208133)，SYPA 5-5是此菌株经过传代5次后得到的菌株，其菌株特性在传代中与SYPW保持一致。目前，尚未见关于钝齿棒杆菌精氨酸转运蛋白LysE的具体研究报道。

发明内容

本发明首先从钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5(菌株的保藏编号为CCTCC NO：M208133)中克隆出编码转运蛋白的基因lysE，并将该基因与穿梭表达质粒pJC-tac连接(pJC-tac详细构建过程及其特征已在已申请的专利中公开，专利公开号：CN101397548A)，成功构建了携带lysE基因的穿梭表达质粒pJC-tac-lysE，并电转入钝齿棒杆菌SYPA5-5中，获得加强lysE基因表达的重组钝齿棒杆菌pJC-tac-lysE/C.crenatum。并对原始菌及重组菌进行平板显色定性检测和基本培养基培养实验考查L-精氨酸转运情况，验证了L-精氨酸转运蛋白LysE在钝齿棒杆菌中的过量表达，说明增强LysE的表达能够一定程度上降低胞内L-精氨酸的浓度提高L-精氨酸的产量。

基于以上研究，对原始菌以及重组菌进行250mL摇瓶发酵实验，结果表明，与原始菌株相比，重组菌精氨酸产量提高了约12％，产率最大时提高了11.1％，且发酵周期有所缩短。

附图说明

图1重组质粒pMD18-T-lysE酶切验证结果

1.DNAMaker DL2000；2.PCR product of lysE gene；3.pMD18-T-lysE/BamHI；4.pMD18-T-lysE/BamHI+SalI；5.λDNA/HindIII

图2C.crenatum SYPA 5-5与C.glutamicum ATCC 13032精氨酸转运蛋白基因lysE核苷酸对比

图3重组穿梭表达质粒pJC-tac-lysE的酶切验证