[发明专利]一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法

说明书

技术领域

一种利用重组Bacillus subtilis全细胞转化AD生成ADD的方法，属于基因工程和酶工程领域。 

技术背景

甾体药物可通过全合成或对天然甾体化合物的降解和其官能团的转化获得，甾体药物具有很强的抗感染、刚过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物，2000年甾体药物在全球药物市场的销售额已突破200亿美元，约占世界医药总销售额的6％。 

甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等。可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。 

早期合成甾体药物的原料大多从动物组织液中直接提取，由于这些原料的含量低、来源少、合成路线复杂、回收率低、代价高昂，不能满足生产的需要。薯蓣皂素的发现和应用，为甾体药物的工业化生产提供了丰富而又廉价的原料，但是生产过程需要消耗大量的薯蓣皂素，使皂素价格不断上升，增加了生产成本，且生产过程严重污染环境。 

近年来，薯蓣皂苷元的日益枯竭，各国都在积极寻找新的资源或新方法。植物甾醇作为新的资源为甾体工业注入了新的生命力，并可以从一些废油的下脚料和各类农作物中获得。可以通过微生物选择性边链降解获得重要的甾体药物中间体AD和ADD。可以说目前几乎所有甾体激素药物都是以AD或ADD作为起始原料进行生产的。微生物法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。世界先进国家目前进行甾体药物制备，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到AD和ADD后，再进一步制备。 

3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(3-ketosteroid-Δ¹-dehydrogenase，KSDD或KSTD)也称C1，2位脱氢酶，它是甾体母核降解的关键酶，属于黄素蛋白酶类，位于细胞膜上，能在甾体母核C1和C2之间引入双键，提高原有底物的抗炎活性及经济价值，实现AD向ADD转化，在甾体药物开发上发挥着重要作用。对3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)的深入研究对整个甾体药物行业的发展意义深远。生产更高附加值的ADD最直接有效的方法就是以4-AD为底物，通过微生物一步转化。 

近年来，众多学者成功实现了来源于不同菌株的KSDD的外源表达。不同来源的KSDD在大肠杆菌系统中表达时，主要以无活性的包涵体形式存在，检测不到KSDD酶活或者酶活水平较低。本实验室前期实现了分枝杆菌的KSDD在大肠杆菌体系中的表达，以无活性的包涵体形式存在，未检测到酶活与相关报道的一致。 

本发明通过质粒pMA5，实现了分枝杆菌KSDD在枯草芽孢杆菌168中的可溶性过量表达，酶活达1.75U/mg，全细胞转化AD 12h后转化率达65.7％。分枝杆菌KSDD在枯草系统中表达及全细胞转化AD均为首次报道，且重组子表达的酶活及AD的转化率均较高。枯草 芽孢杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，培养条件简单，发酵周期短，成为微生物甾醇发酵工业潜在生产菌株。 

发明内容

本发明的目的在于提供：通过基因工程手段来获得具有全细胞转化生产ADD能力的微生物的方法。对构建的重组菌株进行酶活力及发酵性能进行研究发现3-甾酮-Δ¹-脱氢酶活力为出发菌的6倍左右，并且得到了较高的转化率。为微生物发酵生产ADD的工业化提供了有益的指导。 

本发明的技术方案：是以基因工程为手段构建一株全细胞转化AD生成ADD重组枯草芽孢杆菌，以TLC及HPLC为方法检测发酵液中产物的生成，筛选阳性重组子，通过酶活力和发酵性能的检测来确定其目标酶的活力及底物转化率。本发明成功构建了一株以4-AD为底物全细胞转化为方法的高产ADD的枯草芽孢杆菌工程菌株，其3-甾酮-Δ¹-脱氢酶活力和底物转化率较出发菌株有较大提高。 

主要试剂：AD，ADD购自美国SIGMA公司 

重组菌株构建方法： 

(1)3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KSDD)基因全序列的克隆