[发明专利]一种提高过氧化氢酶发酵产量的方法

说明书

技术领域

本发明为一种提高过氧化氢酶发酵产量的方法，属于生物技术领域。

背景技术

过氧化氢是一种很强的氧化剂，一直以来应用于食品工业作为杀菌剂和半导体工业作为硅片的洗涤剂。近年来过氧化氢被用于工业废水处理中，其中最常用于含硫、含酚和含氰化物废水的处理，以及气体的洗涤、脱氯等。2006年，过氧化氢全世界的消费量大约220万吨，这是20年前的2倍。但过氧化氢在工业产品和排放物中的残留可能会引起人的身体健康恶化和环境污染。过氧化氢酶(CAT)能有效地催化过氧化氢分解为无毒的水和氧气，并且酶本身没有害。另外在处理工业废水中，H₂O₂中添加CAT可以促进降解芳环化合物和脂族化合物，H₂O₂中添加CAT处理生物过滤器，还可提高其对废水脱臭效果。因此极大的刺激了微生物发酵产过氧化氢酶的研究热情。

目前国内外CAT市场需求量大增，然而微生物产酶低而导致成本较高仍是目前有待解决的主要问题，因此发酵产CAT的调控机理已逐渐受到关注，不少学者提出了通过外源添加过氧化氢、活性氧、甲奈醌、乙醇诱导CAT表达的发酵策略，然而上述诱导物质存在发酵过程胁迫不易控制且操作复杂，产量提高非常有限，不适于工业化生产，这促使我们去探索研究既能提高过氧化氢酶产量又能适用工业化生产的方法，本发明就是在这样的指导思想下，经过多次试验获得成功的。

发明内容

本发明研究出在产酶培养基中添加100mg/L-200mg/L烟酸作为诱导剂后，调控了菌体的生理代谢，再进行发酵，可明显提高过氧化氢酶的活力达1.3倍以上，相当于增加过氧化氢酶产量30％以上，且适用于工业化生产。

本发明的技术方案：用以2009年11月16日已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 3449的一株高产过氧化氢酶的Serratia marcesces SYBC08菌株为出发菌种，经种子培养和在产酶培养基中添加100mg/L-200mg/L烟酸作为诱导剂后，调控了菌体的生理代谢，再进行深层发酵，可显著过氧化氢酶的产量，且适用于工业化生产，工艺为：

(1)种子培养

LB平板培养基：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母浸膏5g/L，琼脂25g/L，121℃灭菌30分钟，冷却。

种子培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，牛肉膏5g/L，121℃灭菌30分钟，冷却。

从斜面上挑取单菌落，划线于LB平板培养基，将平板置于30℃培养箱培养24h。再从平板上括取两环菌种接种到含50mL种子培养基的250mL三角瓶进行培养，培养条件：pH7.0，培养时间12h，温度30℃，摇瓶转速200r/min，即为发酵种子液。

(2)发酵产酶

产酶培养基：20g/L～40g/L玉米浆粉，20g/L～40g/L柠檬酸，100mg/L-200mg/L烟酸，消泡剂0.2-0.5g/L，121℃灭菌30分钟，冷却。

以2％接种量将发酵种子液接种到含5L产酶培养基的7L发酵罐进行发酵产酶。

发酵条件：pH6.5～8.0，温度30～34℃，发酵时间25～30h，转速300～500r/min，通气量1.2～1.7L/min/L。

(3)过氧化氢酶提取

将发酵液进行离心或过滤，收集的菌体细胞采用高压细胞破碎，破碎机压力控制在2000bar及以上，破碎菌液按过氧化氢酶活力测定方法测定酶活力并按发酵液等体积计算CAT产量U/ml。

(4)酶活的测定方法

3ml反应体系中包括粗酶液0.1ml，pH＝7.00的1mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液2.4ml，新鲜配制的0.12mol/L H₂O₂溶液0.5ml。以去离子水替代H₂O₂溶液作为空白对照，以波长240nm体系下吸光度的下降来衡量过氧化氢的酶促降解速度，每隔10s读取一次吸光度值，一般持续进行1min后停止测定，以反应的线性范围计算酶活U/ml，一个标准酶活力定义为：在最适温度下，每分钟分解1μmolH₂O₂所需的酶量。

本发明的有益效果：