[发明专利]一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。

（二）背景技术

(S)-(+)-扁桃酸乙酯(Ethyl(S)-(+)-mandelate)，CAS登录号：13704-09-1，分子式C₁₀H₁₂O₃，分子量180.2。它是一种重要的手性药物中间体，可以广泛地用于合成手性酸，手性醇，手性胺类化合物，手性氨基醇和手性硫醇等。(S)-(+)-扁桃酸乙酯水解后制备的(S)-(+)-扁桃酸在医药工业中可用于头孢羟唑、血管扩张药环扁桃酸酯、滴眼药羟苄唑等的中间体，也可作防腐剂。

(S)-(+)-扁桃酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原苯甲酰甲酸乙酯可以获得(S)-(+)-扁桃酸乙酯。采用化学法不对称还原苯甲酰甲酸乙酯需要在价格昂贵的手性催化剂的催化下才能完成。化学还原过程中手性催化剂价格昂贵、制备过程繁琐。采用含有羰基还原酶的微生物细胞为生物催化剂不对称还原苯甲酰甲酸乙酯具有反应条件温和、立体选择性好、成本低廉的特点。

生物转化过程可以在不同的反应体系中进行。最为传统的反应体系是水相体系，在水相体系中进行生物转化微生物的催化活性较高，但是有机底物浓度过高时生物转化效率会急剧下降。为了解决高底物浓度对细胞催化活性的抑制作用，采用生物相容性好的有机溶剂用于生物转化过程，在生物相容性较好的有机溶剂中微生物能够保持较好地催化活性，有机底物能够很好地分散于反应溶剂中，从而避免底物和产物在反应溶剂中局部浓度不均一而导致催化效率降低的现象。也可以采用水/有机溶剂两相体系作为反应介质，可以确保微生物在水溶液中具有良好的生物学活性。底物和产物在有机介质中具有较大的溶解度，有利于实现产物的分离提取。采用固定化细胞进行生物转化可以较大程度保护细胞的催化活性，同时有利于产物的分离提取，有利于微生物细胞的重复利用，提高生产效率。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266为生物催化剂，生物催化苯甲酰甲酸乙酯制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法。

本发明采用的技术方案是：

一种苯甲酰甲酸乙酯微生物转化制备(S)-(+)-扁桃酸乙酯的方法，所述方法包括：以苯甲酰甲酸乙酯为底物，以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC No.2266在发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在水和正己烷两相体系中，于20~35℃下进行转化反应8~120小时，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-扁桃酸乙酯；所述水和正己烷两相体系中，水与正己烷体积比为1:0.2~5（优选1:1），在所述水和正己烷两相体系中，底物苯甲酰甲酸乙酯的初始浓度为1~200mmol/L（优选5~50mmol/L）。

本发明中所用的菌株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCCNo.2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到的，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期2007年11月26日，已在CN101230319A中披露。该菌株菌落特征：在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。

所述含酶菌体细胞可直接以发酵液形式参与反应，也可经过滤后以湿菌体细胞形式参与反应，或者经固定化之后作为生物催化剂参与反应。

优选的，所述含酶菌体细胞经固定化之后作为生物催化剂，其用量为：每L水和正己烷两相体系中含有的生物催化剂相当于以包埋法将1.0~4.0g（以干重计）的含酶菌体细胞固定化后再经增殖培养16~72小时获得的固定化细胞颗粒。

所述生物催化剂（固定化细胞颗粒）制备方法如下：将酿酒酵母菌株CGMCC No.2266发酵培养获得的菌体浓度为3.0~10.0g/L的发酵液与等体积质量浓度1~5%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀得到混合液，将混合液逐滴滴入足量质量浓度为2.5~4.0%的氯化钙溶液中，连续搅拌得到固定化悬浮液，放置于35~38℃条件下固化，得到的固定化颗粒用无菌生理盐水洗涤后，分散于发酵培养基中进行增殖培养16~72h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，即为生物催化剂。所述的固定化细胞颗粒的直径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为1~5mm，最优选2mm。