[发明专利]山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法

权利要求书

1.山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，包括以下步骤：

－材料扩繁；

－茎尖剥取；

－预培养；

－藻酸钙包埋成球；

－无菌空气流干燥；

－装入冷冻管；

－投入液氮超低温保存；

－化冻；

－恢复再生培养。

2.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：材料扩繁，将无菌苗培养在825 mg/L NH4NO3、950mg/L KNO3、220mg/L CaCl2·2H2O、185mg/L MgSO4·7H2O、85mg/L KH2PO4的MS + 0.1mg/L BA + 20g/L蔗糖 + 7g/L琼脂的培养基上，PH 5.8，温度20±2℃，光照时间16h，每35～40d 继代1次。

3.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：茎尖剥取,在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小约1～3mm的离体茎尖为材料。

4.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：预培养,剥取的茎尖在20℃或25℃条件下用含0.3mol/L蔗糖的MS固体培养基预培养1～2d。

5.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：藻酸钙包埋成球,将预培养后的离体茎尖置于含25g/L海藻酸钠 + 2mol/L甘油 + 0.8mol/L蔗糖的无钙MS培养液中,用无菌滴管或移液器吸取含一个茎尖的无钙MS培养液滴至含0.1mol/L氯化钙 + 2mol/L甘油 + 0.8mol/L蔗糖的培养液中, 并于25℃保持25～30 min使之成包埋球,每个包埋球大小约4～5mm，含有一个茎尖。

6.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：无菌空气流干燥,将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上, 在无菌空气流中干燥3～5h。

7.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥法超低温保存及其再生培养方法，其特征在于：装入冷冻管,无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10～20个包埋球。

8.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：投入液氮超低温保存，将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。

9.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥法超低温保存及其再生培养方法，其特征在于：化冻,从液氮中取出冷冻管，在38～40℃水浴中化冻1.5～3min。

10.根据权利要求1所述的山葵试管苗离体茎尖包埋干燥超低温保存及再生培养方法，其特征在于：恢复再生培养，化冻后的包埋球在KNO3 950mg/L和NH4NO3 825mg/L的MS + 0.1mg/LBA + 30g/L蔗糖 + 6.5g/L琼脂，PH 5.8的培养基中进行恢复培养,先在黑暗条件或弱光下培养8－10天后,再转入与继代培养相同的条件下培养。