[发明专利]一种生产体细胞克隆牛囊胚的方法在审
| 申请号： | 201210211817.4 | 申请日： | 2012-06-20 |
| 公开（公告）号： | CN102766655A | 公开（公告）日： | 2012-11-07 |
| 发明（设计）人： | 杜卫华;朱化彬 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N15/877 | 分类号： | C12N15/877 |
| 代理公司： | 北京集佳知识产权代理有限公司 11227 | 代理人： | 冯琼;姜义民 |
| 地址： | 100193 *** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 生产 体细胞 克隆 囊胚 方法 | ||
1.一种生产体细胞克隆牛囊胚的方法，包括以下步骤：
(1)以牛耳缘成纤维细胞为核移植供体细胞；
(2)将牛卵母细胞进行体外成熟培养，将体外培养成熟并排出第一极体的卵母细胞作为核移植受体细胞；
(3)将步骤(2)所得卵母细胞挤压去核并去除透明带；
(4)先将一枚步骤(3)所得卵母细胞与一枚供体细胞用PHA法黏附形成复合体，施以交流电，再将另一枚步骤(3)所得卵母细胞黏附在上述复合体上，使其排列顺序为卵母细胞-供体细胞-卵母细胞；最后施以直流电对其进行融合，构建重构胚胎；
(5)所述重构胚胎激活后，进行体外培养得克隆囊胚。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛耳缘成纤维细胞的代龄为5-15代，在核移植前经过血清饥饿处理或不经过血清饥饿处理。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛卵母细胞是由直径为2-8mm的牛卵泡中采集的、由完整致密的卵丘细胞包裹的卵母细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述体外成熟培养的培养基的制备方法为，在TCM199培养基中添加体积百分比为10%的FBS，0.01IU/ml的FSH，0.01IU/ml的LH和1μg/ml的E2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述挤压去核是在显微镜下用拔尖的去核针挑破第一极体处的透明带，并将第一极体及其下方的胞质挤除；所述去透明带是用链酶蛋白酶消化去除。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电融合与所述重构胚胎激活的间隔时间为1-3h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述电融合与所述重构胚胎激活的间隔时间为2h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重构胚胎的激活为A23187与6-DMAP的联合激活。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重构胚胎的体外培养液为CR1aa、mCR1aa或SOFaaci。
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