[发明专利]一种改进的DNA配基筛选方法

说明书

技术领域

本发明建立了一种改进的配基筛选方法。包括随机筛选配基文库的合成、蛋白分子与载体连接、文库与连接有蛋白或多肽或化学小分子的载体进行孵育反应、洗涤未结合的配基、直接将载体-分子-配基作为模板进行扩增、测序等步骤。本发明采用随机合成的DNA文库，通过随机文库与特定蛋白孵育、PCR扩增和测序等步骤筛选可以与特定蛋白相结合的单链DNA链。在扩增与特定蛋白有亲和活性的配基时，将结合有特定蛋白和配基的琼脂糖载体作为模板直接加入到PCR体系中，进行扩增。该方法省略了将DNA配基从载体上洗脱和纯化的过程，简化了操作步骤，提高了扩增成功率。该方法可以用于蛋白配基、多肽配基以及化学小分子配基的筛选。

背景技术

指数富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)是一项将文库技术(library)与筛选技术相结合的新技术，可以从构建的随机核酸文库中筛选出与靶分子特异结合的核酸配基。其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度在40nt左右，文库容量在10¹⁴～10¹⁵之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA短链易形成发卡、G-四聚体等多种二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸等有机分子，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶分子相互作用，洗脱筛选出特异寡核苷酸配基（aptamer），经RT-PCR或PCR及体外转录生成新的次一级文库，再与该靶结合，反复多个循环，可筛选出能与该靶分子特异结合的寡核苷酸片段。

SELEX技术主要有以下优点：①靶分子范围广泛，包括肽、氨基酸、蛋白质（包括细胞膜蛋白）、金属离子、染料、药物小分子（如茶碱）、生长因子、类固醇、基因调节因子、细胞黏附因子、植物血凝素，甚至可以是完整的细胞、孢子等；②筛选到的配体具有高亲和力、高特异性，结合力可以与单抗和抗原之间的结合相媲美，其解离常数（Kd）多在pmol/L-nmol/L级，能够分辨出靶分子结构上细微的差别，甚至可以区分1个甲基或1个羟基的差别；③适体无免疫原性，无毒性，稳定性好，可长期保存，能在常温下运输，容易再生，组织穿透力强，可用于细胞内诊断和治疗；④适体易于添加报告基团，可以在合成时精确、定点连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基、萤光素、生物素、酶等；⑤不依靠动物，筛选周期短，一般一个SELEX需要8～15个循环，约2～3个月时间，目前其筛选过程已经可以自动化，大大加快了筛选速度，而制备单克隆抗体，即使很顺利也需要3～6个月；⑥化学合成的适体精确度高，重复性强，生产中很少存在批次间的差异。目前，已经有适体作为药物进入临床试验阶段。2002年，抗血管内皮生长因子（VEGF）适体EYE001用于治疗老年性视网膜退化性变（AMD），率先进入第一阶段的临床试验。3个月后，15名接受适体治疗的患者中有80％视力稳定或得到改善，结果证实该适体的安全性较好；第二阶段临床试验显示，21名患者在接受抗VEGF适体玻璃体注射治疗3个月后，有87.5％视力稳定或得到改善且没有不良反应。2004年12月美国食品与药品管理署（FDA）正式批准第一种适体药物Macugen上市，用于AMD的治疗。SELEX技术自1990年问世以来，在基础研究、药物开发、临床治疗中的应用不断增多。

发明内容

本发明克服了SELEX技术操作步骤多，建立了一种简化的配基筛选技术。其工作原理为：在连接了蛋白或者多肽或者化学小分子等目标分子的载体与配基结合后，通过洗涤，去除非特异性结合的配基，然后将结合有目标分子和配基的载体直接加入到PCR反应体系中进行扩增，反复重复配基筛选和扩增过程，富集与目标分子可以特异性结合的DNA配基，最后通过测序得到DNA配基序列。

本发明所采用的方法是：

将目标蛋白与载体连接；

合成并扩增两端有特定引物序列的随机DNA文库；

将扩增的DNA文库与完成蛋白连接的载体进行反应；

通过洗涤步骤去除未结合的DNA，完成筛选步骤；

将连接有蛋白和配基的载体作为模板进行PCR扩增反应；

重复筛选步骤和扩增步骤；

将扩增得到的序列连接克隆载体后进行测序，得到与目标蛋白有结合活性的DNA配基。

该检测方法与其他检测方法相比具有如下优点：