[发明专利]鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法

说明书

技术领域：

本发明属于利用分子生物学方法检测一种常见毒蘑菇的技术领域，具体涉及一种用于鉴别致命鹅膏（Amanita exitialis）的特征性核苷酸序列、核酸分子探针和方法

背景技术：

鹅膏属（Amanita）是世界性分布的大属，隶属于真菌界、担子菌门、担子菌纲、蘑菇目、鹅膏科。据《真菌学词典》第十版(2008)记载，全世界鹅膏属种类已达500种，中国已知种类近100种（杨祝良，2005），它们的一些种类如产于东亚的致命鹅膏（A.exitialis）、灰花纹鹅膏（A.fuliginea）等都属于剧毒蘑菇种类。成年人若误食致命鹅膏或灰花纹鹅膏的一个子实体，不及时抢救，就足以致命(陈作红等,2003)。目前，误食毒蘑菇致死是我国食物中毒致死的主要原因，蘑菇中毒的死亡率高达43.80%，是目前死亡率最高的严重突发公共卫生事件(2007)。因此，快速、准确的鉴别致命鹅膏的方法对于抢救误食致命鹅膏的患者具有重要的意义。

随着分子生物学技术的快速发展以及计算机辅助分析技术的诞生，真菌的快速检测已成为可能。目前常用的检测方法主要有RAPD、RFLP、ap-PCR、rDNA序列分析和特异性引物的PCR检测等。真菌的ITS序列是核糖体DNA上的一个非编码区域，受外界环境因素的影响较小，进化速度快，因而可以提供较为丰富的信息位点。利用真菌rDNA-ITS序列在属、种水平上的差异，设计特异性引物，进行真菌物种的鉴定、检测，已经成为国际上广泛使用的分子生物学方法。目前，已有用于鉴别部分真菌的核苷酸特征序列获得专利，但尚未发现专一性鉴别致命鹅膏的核苷酸序列专利。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供了一种利用分子生物学手段，获得鉴别致命鹅膏（A.exitialis）的特征性核苷酸序列。

本发明用于鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列来源于致命鹅膏的核糖体rDNA内转录间隔区ITS1、ITS2和它们之间的5.8S rDNA基因，具体序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种基于致命鹅膏的特征性核苷酸序列（SEQ ID NO.1）设计的用于鉴别致命鹅膏的核酸分子探针，该核酸分子探针序列如下：

ZMF：5`-GAAGTTGAAATCTGGGTG-3`；

ZMR：5`-TAACTAGCATTGCTCCTG-3`。

上述核酸分子探针序列ZMF和ZMR，它们的退火温度相近，均不能形成引物二聚体，具有极高的专一性，仅与致命鹅膏发生反应，而不与其他鹅膏反应。利用该探针通过PCR扩增可以快速的对致命鹅膏（菌丝体、子实体）进行鉴别。

本发明的第三个目的是提供一种致命鹅膏快速鉴定试剂盒，包括上述核酸分子探针ZMF和ZMR，以及常规的DNA提取试剂和常规的PCR反应试剂。

所述的致命鹅膏快速鉴定试剂盒优选还包括真菌核糖体rDNA的内转录间隔区通用引物ITS1：5`-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3`；ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`。该通用引物可以作为鉴定致命鹅膏的阳性对照。

本发明的第四个目的是提供一种鉴别致命鹅膏的方法。本方法是采用上述核酸分子探针ZMF和ZMR作为特异性扩增引物，以致命鹅膏基因组DNA为模板，经PCR扩增，电泳检测，获得清晰的致命鹅膏特异性条带，实现对致命鹅膏的鉴别。

优选，利用ITS1和ITS4作为PCR引物，以致命鹅膏的基因组DNA作为模板进行常规的PCR，以作为阳性对照。

本发明基于鉴别致命鹅膏的特征性核苷酸序列（SEQ ID NO.1）设计了特异性的核酸分子探针ZMF和ZMR，并以该核酸分子探针为引物，以致命鹅膏的基因组DNA为模板，按照常规PCR方法进行扩增，获得的DNA片段，经测序其具体序列如SEQ ID NO.1的第124~524位碱基所示，长度为401bp。利用本发明的核酸分子探针ZMF和ZMR进行PCR扩增，仅致命鹅膏能够扩增获得该特异性片段，而其他样品没有扩增到任何片段（如图3），这表明本发明的核酸分子探针ZMF和ZMR具有极高的专一性，可以用于快速的鉴别致命鹅膏（子实体和菌丝体）。

本发明采用PCR技术进行检测，材料用量少，仅20mg就足够，方法简单，特异性好，用时短，半日即可完成。

附图说明：