[发明专利]可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种可在乳酸乳球菌中表达外源蛋白、且使表达蛋白展示于菌体表面的表达载体，同时还涉及该载体的制备方法与应用。 

背景技术

目前，对于一些消化道病原体感染，例如幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）感染，由于采用抗菌素治疗可使细菌耐药性增加、且对重复感染无预防作用，故对这类疾病更有效的防治只能寄希望于疫苗的研究成功。在疫苗研究中，口服疫苗以其免疫途径安全、合理、方便等优点而受到关注[Levine MM.IDEALvaccines for resource poor settings.Vaccine,2011,29 Suppl 4:D116-25.]。但是，目前口服疫苗研究发展因缺乏理想的疫苗载体而受到制约[Zhang S,Moise L,Moss SF.H.pylori vaccines:why we still don't have any.Hum Vaccin,2011,7(11):1153-7.]。现有研究多采用减毒伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)作为口服疫苗载体[Becher D,Deutscher ME,Simpfendorfer KR,Wijburg OL,Pederson JS,Lew AM,Strugnell RA,Walduck AK.Local recall responses in the stomach involving reduced regulation and expanded help mediate vaccine-induced protection against Helicobacter pylori in mice.Eur J Immunol,2010,40(10):2778-2790.]，结果显示，虽然此类候选疫苗株在动物体内可产生较好的免疫效果，但由于存在安全性问题，而不适用于婴幼儿、老年人及免疫缺陷者。探讨更安全有效的口服疫苗载体是该领域研究的发展趋势，对口服疫苗的研制起关键性作用。 

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis,L.lactis）是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级益生菌，安全性十分可靠，而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有用作口服疫苗载体的很大潜力[Morello E,Bermúdez-Humarán LG,Llull D,et al.Lactococcus lactis,an efficient cell factory for recombinant protein production and secretion.J Mol Microbiol Biotechnol,2008,14(1-3):48-58.]。目前应用最为广泛的乳酸菌表达系统是NICE（Nisin-controlled expression）系统[Ribeiro LA,Azevedo V, Le LoirY,et al.Production and targeting of the Brucella abortus antigen L7/L12 in Lactococcus lactis: a first step towards food-grade live vaccines against brucellosis.Appl Environ Microbiol,2002,68(2):910-916.]。在此系统中，NisK是敏感激酶， NisR是反应蛋白，当有微量的乳酸链球菌素nisin加入该表达系统时，即可被蛋白激酶NisK识别并与之结合，而结合nisin的NisK通过磷酸化激活NisR，激活的NisR蛋白即诱导连接于nisA启动子后的目的基因表达。为了使用NICE系统进行基因表达，受体蛋白和反应因子基因即nisK和nisR被分离并整合到合适宿主菌的基因组中，而nisA启动子基因则整合到质粒上，当目的基因克隆到启动子下游且质粒转化入nisKR阳性菌株中，在宿主菌生长至对数生长期时加入微量nisin即可诱导目的基因表达[Mierau I,Kleerebezem M.10years of the nisin-controlled gene expression system(NICE)in Lactococcus lactis.Appl Microbiol Biotechnol,2005,68(6):705-17.]。NICE表达系统具有以下优点：诱导剂nisin在食品工业中作为防腐剂应用已有多年，被认为是具有食品级安全性的添加剂；nisin价格低廉，而且用量很小；加入nisin后目的蛋白能达到较高的表达水平。[Kuipers OP，de Ruyter PG,Kleerebezem M,et al.Controlled overproduction of proteins by lactic acid bacteria.Trends Biotechnol,1997,15(4):135-140.]。正是由于NICE系统的上述优点，该系统已成为乳酸菌类最有前途的诱导表达系统之一。