[发明专利]一种短肽激素与重组假单胞菌外毒素A的重组融合蛋白及应用

说明书

  

技术领域

本发明总地涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质。更具体地说，本发明涉及与促性腺激素释放激素融合的重组假单胞菌外毒素A功能片段（PE39）的构建，以及所说的重组细胞毒性融合蛋白作为抗肿瘤剂，在抑制类固醇激素刺激的肿瘤的发生和发育中的应用。 

背景技术

目前研究较多且较深入的细胞毒性剂是假单胞菌外毒素A（PEA）（参见美国专利4,545,985)。PEA是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PE分子的X射线晶体学研究和突变分析显示，PE分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域：负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(I区）；负责毒素分子向细胞溶胶内转位的中间转位区〔II区）；以及负责失活蛋白质并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(III区）。其中I区包括介导细胞结合的1α区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ib区(氨基酸365-399)。使用重组DNA技术修饰PE分子，以制备PE分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PE片段，例如， 一般将删去了 PE分子中la区，只含有酶促和转位区，分子量约为40KDa的PE-蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的1α区和部分II区（359-365位氨基酸），即PE39毒素分子，该分子仍保留其特异性细胞毒性，但降低了非特异性毒性（Mol Microbiol. 1999 Mar;31(5):1385-93；美国专利4,892,827 )。将PE40分子的羧基端REDLK置换成KDEL,其活性可提高6～10倍（US Patent 5602095, Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity）。本发明为了得到活性更高的并可以规模化分离纯化及切割的靶向融合蛋白，针对靶向融合蛋白GnRH-PE40KDEL蛋白及核酸序列进行了如下改构: 

1．  将GnRH-PE40KDEL的359-365位氨基酸进行了缺失（即为GnRH-PE39KDEL）（PROTEIN SEQ ID NO:1）；

2．  针对于大肠杆菌和铜绿假单胞菌密码子偏好性的差异，重新设计优化适合大肠杆菌的密码子，通过人工合成的方法合成全长核酸序列GnRH-PE39KDEL（NUCLEAR SEQ ID NO:1）。使用改造后的pET-His作为重组蛋白的表达载体；

3．  为纯化目的蛋白使用组氨酸标签（6×His），同时减小了重组蛋白的分子量；

4．  为去除载体中的标签序列，设计了不同的蛋白酶切位点：

A.  Factor Xa蛋白酶酶切位点Ile-Glu/Asp-Gly-Arg^▼（PROTEIN SEQ ID NO:2，3；NUCLEAR SEQ ID NO:2，3）；

B.  Thrombin蛋白酶酶切位点Leu-Val-Pro-Arg-^▼-Gly-Ser （PROTEIN SEQ ID NO:4；NUCLEAR SEQ ID NO:4）；

C.  HRV 3c和PreScission蛋白酶酶切位点Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-^▼-Gly-Pro（PROTEIN SEQ ID NO:5；NUCLEAR SEQ ID NO:5）；

5．  在4.中所述的碱基序列末端均加入终止密码子TGA。

6．  针对于真核生物和原核生物的密码子偏好性的不同，依据相同的氨基酸序列，借助基因工程碱基合成的方法，重新设计具有适应于大肠杆菌密码子偏好性、无发卡结构且可以在大肠杆菌中高表达的工程菌菌株。 

最终我们得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL（PROTEIN SEQ ID NO:1），在肿瘤治疗方面有很高的应用价值。 

传统的肿瘤治疗方法是使用化学药物直接杀伤体内的肿瘤细胞。然而，大多数抗肿瘤药物在杀伤肿瘤的同时还杀伤正常细胞。为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性，自20世纪70年代后期以来，人们就试图将某些抗肿瘤药物或本来缺乏靶向选择性的毒素（包括细菌或动植物来源的毒素）化学偶联到适当的导向分子或称识别分子上，以制备杂交的具有耙特异性的抗肿瘤剂。随着分子生物学技术的发展, 进而建立了以DNA重组技术制备这样的融合蛋白质的方法。