[发明专利]一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程、生物催化与生物转化，尤其是涉及一种构建辅酶氧化酶基因与脱氢酶类基因融合的方法和应用。

背景技术

辅酶氧化酶是一类能催化辅酶氧化，将电子从辅酶传给H₂O₂或H₂O的酶类，实现了氧化型辅酶的再生，调节细胞内还原型辅酶和氧化性辅酶的水平，从而对细胞内代谢流向的控制与能量平衡发挥着不可替代的作用。迄今为止，已经有多种酶被研究用来转化再生NAD⁺：如，谷氨酸盐脱氢酶（GluDH）、乳酸脱氢酶（LDH）、乙醇脱氢酶（ADH）、NADH氧化酶（NOX）。而NADH氧化酶由于以O₂为底物，不需要添加新的底物；没有副产物产生，且终产物水不会对与之偶联的酶产生抑制；产物容易分离这些优点而被广泛应用，其主要生理能：（1）维持细胞内NADH/NAD⁺平衡，调节细胞代谢过程。胞内氧化还原水平是维持细胞生长和代谢的基本必要条件，而细胞内氧化还原水平极大地依赖于胞内两种嘧啶核苷酸系统，即NADH/NAD⁺和NADPH/NADP⁺浓度的比率。（2）作为细胞内氧代谢酶，清除细胞内氧毒性。研究表明：氧气本身不会对细胞产生影响，然而在细胞代谢过程中形成的含氧中间物（如O₂、OH^-、H₂O₂等）会对细胞产生氧毒性（Fridovich I,et al.Biology,1998，201:1203-1209）。细菌中NOX的存在使这些具有氧毒害作用的中间体维持在低水平状态，从而起到了保护细胞免遭氧毒害的作用。（3）发挥氧传感器作用。

脱氢酶是一类催化物质氧化还原反应的酶，天然受体是NAD+或NADP+，脱氢酶的底物经这类脱氢酶的催化使NAD（P）+还原生成NAD（P）H。甘油脱氢酶（GDH）作为其中一种常见的依赖辅酶的氧化还原酶。GDH主要分为三种类型，其中有一种是依赖NAD+的GDH（EC1.1.1.6）,能将甘油转化为DHA，DHA进一步磷酸化，进入糖酵解途径，作为碳源为微生物生长提供ATP和NADH，在这个过程中伴随着NAD+还原生成NADH，这种GDH主要存在于各种细菌中，如Bacillus substilis,Aerobacter areogenes,Escherichia coli和cellulomonassp.等；另一种为依赖NADP+的GDH（EC1.1.1.72和EC1.1.1.56），它将甘油氧化为DHA或甘油醛，期间也伴随着NADP+还原成NADPH，这种GDH主要存在于霉菌和动物组织中。

辅酶是一类可以辅助酶蛋白催化反应的有机小分子（Wagner,et al.ISBN，1975，0-88275-258-8），能与酶蛋白特异性结合，它是特定酶活性发挥所必要的。由于辅酶在酶催化反应中其化学组分发生了变化，因此可以认为辅酶是一种特殊的底物或者称为“第二底物”。其中的辅酶I[NAD(H)]和辅酶II[NADP(H)]是氧化还原酶的最主要辅酶。辅酶I即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，简称为NAD或NAD⁺，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸由一分子烟酰胺核苷酸(NMN)和一分子腺嘌呤二核苷酸联结而成，是氧化还原酶的辅酶，在生物氧化还原系统中起着氢和电子传递作用，还原形式NADH，它出现在细胞很多新陈代谢反应中。NAD⁺在氧化途径中是电子受体，而NADH在还原途径是电子供体。烟酰胺核苷酸(NMN)上吡啶环的C-4位置是辅酶Ⅰ的反应中心，能接受或给出氢负离子，而分子中的腺嘌呤部分不直接参与氧化还原过程（黎高翔，生物工程学报，1985，1(4)：1）氢负离子含两个电子，辅酶在脱氢酶反应起着转移氢负离子(即两个电子)的作用。NAD+辅助脱氢酶蛋白作用，它在糖酵解、糖异生、三羧酸循环和呼吸链中发挥着不可替代的作用。中间产物会将脱下的氢递给NAD⁺，使之成为NADH。