[发明专利]一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于奶牛乳房炎疫苗的制备方法是按照以下步骤进行的：

一、金黄色葡萄球菌毒素制备

a、用接种环挑取金黄色葡萄球菌，接种于营养肉汤中，置于37℃培养箱中培养18~24h，得培养液；吸取10μL的培养液于血液琼脂平板培养基上涂布均匀，在37℃培养箱中培养18~24h后，挑取一接种环直径大于1mm的单菌落，接种于营养琼脂斜面培养基，然后置于37℃培养箱中培养18~24h，得金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物；挑取一接种环金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面培养物，接种于产毒培养基中，在37℃条件下振荡培养18~24h，即为种子液；b、将步骤a得到的种子液按体积百分含量为1％~3%的接种量接种于产毒培养基内，然后在温度为37℃，转速为180~250r/min的条件下培养18~24h后，在3000r/min的条件下离心30min，同时收集上清液与沉淀，收集的上清液即为金黄色葡萄球菌毒素；收集的沉淀，备用；

二、金黄色葡萄球菌类毒素制备

c、取步骤一制得的金黄色葡萄球菌毒素，以1N的NaOH溶液调节pH值至6.5~8.5，然后加甲醛至甲醛体积浓度为0.2％~0.5％，置于37℃培养箱中解毒3~7d，即得金黄色葡萄球菌类毒素原液；d、将步骤c得到的金黄色葡萄球菌类毒素原液用滤纸过滤，向滤液中加入医用氯化钠至氯化钠质量浓度为10％~20％，然后以2N的HCl溶液调节pH值至2.0~4.0，静置过夜；e、将步骤d过夜处理后的金黄色葡萄球菌类毒素原液在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀再用无菌重蒸水离心洗涤沉淀1~2次，收集洗涤后的沉淀溶于pH为6.5~8.5的磷酸缓冲液中，再次在3000r/min转速下离心10min，收集沉淀并向沉淀中加入质量浓度为1％的硫柳汞溶液至硫柳汞质量浓度为0.01％，即得金黄色葡萄球菌类毒素；其中，磷酸缓冲液与金黄色葡萄球菌类毒素原液体积比为1:15~30；

三、金黄色葡萄球菌菌体蛋白的制备

取步骤一中收集的沉淀，用0~4℃无菌生理盐水离心洗涤3次，取上清，收集沉淀，将收集的沉淀和无菌玻璃珠按质量比为1:3~5的比例放入无菌匀浆杯中混合，再加入0~4℃无菌生理盐水至杯满，采用匀浆器在温度为5℃，转速为4000r/min的条件下振动12min，然后在转速为14000r/min，温度为5℃的条件下离心40min，收集上清液，用0.5N的HCl溶液调节上清液pH值至3.0~5.0，再次在转速为7000r/min，温度为5℃的条件下离心30min，收集沉淀，装入透析袋中，经48~96h流水透析，即得金黄色葡萄球菌菌体蛋白；

四、无乳链球菌菌苗的制备

制备菌量为1.5~3.0×10⁹的无乳链球菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；

五、大肠杆菌菌苗的制备

制备菌量为1.5~3.0×10⁹的大肠杆菌菌苗，置于4℃的冰箱中保存备用；

六、奶牛乳房炎疫苗的制备

将步骤二得到的金黄色葡萄球菌类毒素、步骤三得到的金黄色葡萄球菌菌体蛋白、步骤四得到的无乳链球菌菌苗和步骤五得到的大肠杆菌菌苗混合后，即得奶牛乳房炎疫苗；其中，每毫升奶牛乳房炎疫苗含金黄色葡萄球菌类毒素的效价为10~30U，金黄色葡萄球菌菌体蛋白的蛋白质含量为200~400μg，无乳链球菌的菌数为1.5~3.0×10⁹，大肠杆菌的菌数为1.5~3.0×10⁹。

2.根据权利要求1所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤一至步骤六所进行的操作均在无菌条件下进行。

3.根据权利要求1或2所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤一中所述的金黄色葡萄球菌毒素效价为1024~4096。

4.根据权利要求3所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤二中所述的金黄色葡萄球菌类毒素效价为128~256。

5.根据权利要求4所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中所述的金黄色葡萄球菌菌体蛋白中蛋白质含量为10~50mg/mL。

6.根据权利要求5所述一种奶牛乳房炎疫苗的制备方法，其特征在于步骤三中所述的无菌玻璃珠为