[发明专利]一种顶头孢霉工程菌及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种顶头孢霉工程菌及其构建方法。

背景技术

头孢菌素C（Cephalosporin C，CPC）是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头 孢烷酸(7-ACA)的主要原料。目前，工业上主要利用顶头孢霉（Acremonium  chrysogenum）发酵获得CPC。头孢菌素C在顶头孢霉中的生物合成途径已经研究清楚， 且顶头孢霉的遗传操作系统已经成熟，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业真 菌奠定了良好基础。

丝状真菌的次级代谢往往与其体内的氧化还原平衡有着一定的联系，当细胞处于 一定的氧化状态时可能更有利于某些次级代谢产物的合成。硫氧还蛋白系统 （thioredox system）是存在于绝大多数生物体中的一类抗氧化系统，具有十分广泛 的功能。硫氧还蛋白从氧化态转化成还原态依赖于硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin  reductase，TrxR)的催化作用。因而，TrxR对于胞内的氧化还原平衡或某些蛋白分 子的氧化还原状态具有重要的调控作用。破坏顶头孢霉的TrxR编码基因（TrxR）可能 会导致细胞的氧化压力增强，并刺激头孢菌素的生物合成。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种顶头孢霉工程菌的构建方法，是抑制顶头孢霉 （Acremonium chrysogenum）中序列表序列1所示蛋白的表达得到的头孢菌素C合成 能力高于所述顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）的工程菌菌株。

在上述方法中，所述抑制顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）中序列表序列1 蛋白的表达通过敲除序列表序列1所示蛋白的编码基因实现。

在上述方法中，所述敲除序列表序列1所示蛋白的编码基因通过同源重组的方式 进行。

在上述方法中，所述蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）的基因：

1）序列表序列2所示的DNA分子；

2）与1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白 的DNA分子；

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄ 和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为： 50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC， 0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶 液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、 0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂 洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在 65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃ 下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

在上述方法中，所述敲除包括将如下DNA片段导入所述顶头孢霉的步骤：5’端 连接有序列表序列3所示序列且3’端连接有序列表序列4所示序列的DNA片段。

在上述方法中，所述DNA片段是通过重组质粒pAg1-ActrxRDM导入所述顶头孢霉 的，所述重组质粒pAg-1ActrxRDM是在质粒pAg1-H3的SmaI和ApaI的位点间连入序 列表序列3所示的DNA片段，在AscI和SwaI的位点间连入序列表序列4所示的DNA 片段，和在SwaI的位点处连入序列表序列5的第10-1175位所示的DNA片段。