[发明专利]苏云金芽孢杆菌杀虫晶体突变蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学领域，特别涉及一种苏云金芽孢杆菌CrylAa杀虫晶体突变蛋白，其包含选自H168R、N372G或N372A的任一种单点突变，以及它们的应用。

背景技术

自20世纪60年代以来，由于化学类农药对环境的危害日渐突出，而且在农业生产上害虫的抗药性急剧增加，绿色环保的生物防治方法越来越受到人们的关注。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)为革兰氏阳性菌，是一类对害虫毒力强、致死速度快，且对害虫天敌无毒性的昆虫病原微生物，在菌体的稳定生长期可形成伴胞晶体蛋白，又称杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)或δ-内毒素。ICP是由CRY基因和CYT基因编码的，对敏感昆虫有强烈毒性，而对高等动物和人无毒性。Bt是目前世界上生产量最大的生物杀虫剂，已广泛应用于控制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目的害虫，此外还对膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目的多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物有选择性的杀虫活性。由于Bt具有专一性强，对环境友好，对人畜无害，生物降解无残毒等优点，已被广泛应用于农业生产中。

自1981年Schnepf和Whiteley首次成功地克隆了一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因以来，迄今为止，已分离出235种杀虫晶体蛋白(Crickmore et al.，2012)。这些蛋白按其氨基酸序列的同源性已被分为Cry1～Cry70、Cyt1、Cyt2、Cyt3共73类，其中Cry1类含有Cry1A至M，共14亚类。而Cry1Aa是Cry1Aa至Cry1Ai的一个基因家族，Cry1Aa共含有21个基因型，依次命名为Cry1Aa1～Cry1Aa21。

通过对Cry1A，Cry2A，Cry3A等具有代表性的毒素蛋白的三维结构以及Cry杀虫晶体蛋白氨基酸的同源性分析，发现大多数Cry蛋白在一级结构上存在5～8个保守区，而空间结构都为相似的球状蛋白，由三个典型的结构域组成：Domain1位于肽链的N端，为一组由6～7个两亲的α-螺旋(helix)围绕着一个疏水核心的α-螺旋形成的α-螺旋束，参与了细胞膜的穿孔；Domain2位于肽链的中间，由三组反平行的β-折叠片层(sheet)组成，呈β-三棱柱状围成一个三角形的疏水内核，在Domain2顶端的3个环(loop)结构形成一个类似于免疫球蛋白的抗原决定区，参与了毒素与受体蛋白的识别与结合(Wu S.，et al.，1996；Bravo A，et al.，2005)；位于C端的Domain3由两组反平行的β-折叠片层组成的夹心结构，以β果酱卷(jelly roll)拓扑结构排列，主要功能包括保持毒素的稳定性，防止蛋白酶对毒素分子的过度降解、调节毒素的活性、以及与受体的结合等(Jenkins J.，et al.，2005)。不同杀虫晶体蛋白之间的Domain2的差异最大，尤其是位于顶端的loop部分，在氨基酸序列、长度、构象等方面都存在很大的不同，正是由于不同杀虫晶体蛋白之间的这些差异，Domain2被认为是决定蛋白杀虫特异性的重要因子。