[发明专利]基于HiSeq测序技术检测乙型肝炎病毒分型和耐药基因的方法

权利要求书

1.一种确定HBV核酸样本中突变位点类型的方法，其特征在于，包括下列：

使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物；

对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果；以及

基于所述测序结果，确定所述HBV核酸样本中是否存在突变，

其中，所述第一引物组包含第一引物和第二引物，所述第一引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述第二引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，

所述第一引物的5’端进一步包含第一标签序列，所述第一标签序列具有选自如SEQ IDNO：5-52至少之一所示的核苷酸序列，

所述第二引物的5’端进一步包含第二标签序列，所述第二标签序列具有选自如SEQ IDNO：53-100至少之一所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HBV核酸样本是从HBV的宿主中分离的。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HBV核酸样本是从乙肝患者血清样本中分离的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用第一引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第一扩增产物进一步包括：

使用第二引物组，对所述HBV核酸样本进行扩增，以便得到第二扩增产物；以及

使用第一引物组，对所述第二扩增产物进行扩增，以便得到所述第一扩增产物，

其中，

所述第二引物组包括第三引物和第四引物，所述第三引物具有如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，所述第四引物具有如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括通过选自琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种分离纯化所述第一扩增产物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述第一扩增产物进行测序，以便得到测序结果进一步包括：

针对所述第一扩增产物，构建测序文库；以及

对所述测序文库进行测序，以便得到所述测序结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用选自Hiseq 2000、SOLID、454和单分子测序装置的至少一种进行所述测序。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，针对所述第一扩增产物，构建测序文库进一步包括：

将所述第一扩增产物片段化，以便得到DNA片段；

对所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；

对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的DNA片段；

将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；

对所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第三扩增产物；以及

将所述第三扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所述测序文库。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过选自化学打断方法和物理打断方法的至少一种将所述第一扩增产物片段化，其中所述化学方法包括酶切方法，所述物理打断方法包括超声波打断方法和机械打断方法。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的，所述Klenow片段具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性，但缺少5’-3’外切酶活性。

11.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，利用Klenow（3’-5’exo-）对所述经过末端修复的DNA片段进行3’端添加碱基A。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述3’末端添加碱基A的DNA片段与接头相连是利用T4DNA连接酶进行的。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过琼脂糖凝胶电泳、磁珠纯化和纯化柱纯化的至少一种纯化回收所述第三扩增产物。