[发明专利]一种卡拉胶降解菌及其发酵方法和应用

权利要求书

1.一种卡拉胶降解菌，其特征在于：命名为卡拉胶降解菌13-Q，即Pedobacter hainanensis sp.13-Q，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2011年12月9日，其保藏编号为CGMCC NO.5564。

2.按照权利要求1所述卡拉胶降解菌，其特征在于：

菌落形态特征为：在卡拉胶固体培养基上生长良好，菌落黄色，圆形，表面略凸起，光滑，反光，不透明，边缘整齐，直径约为1.0mm；菌体形态特征为：细胞杆状，0.3-0.5μm×1.3-2.0μm，单个或成对排列，革兰氏染色阴性，不生孢，运动；

主要生理生化特征：

在卡拉胶液体培养基中可产生卡拉胶降解酶；好氧；可以利用L-阿拉伯糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露醇、鼠李糖、α-甲基-D-葡萄糖苷、N-乙酰-葡萄糖胺、熊果苷、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖、龙胆二糖、D-松二糖、葡萄糖酸盐。但是葡萄糖和阿拉伯糖产酸。该菌的氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶（C4）、类脂酯酶（C8）反应为阳性；不呈现脲酶、色氨酸脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶活性；该菌不能水解淀粉、明胶、酪素、菊糖等；不生成吲哚和硫化氢；硝酸盐还原呈阴性反应；在麦康凯培养基上不能生长，

脂肪酸组分特征：

主要脂肪酸及比例为iso-C_15∶0(40.4％),iso-C_15∶0 2-OH and/or C_16∶1ω7c(18.9％)and iso-C_17:0 3-OH(18.4％)（图.1），

醌型特征：

主要优势醌为甲基萘醌K7（MK-7），含量大约为92.9％(图.2)，

DNA G+C mol％含量特征：

DNA G+C mol％含量为42.7％，

遗传学特征：

所述卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q菌株的16S rRNA全基因碱基序列（表.1）；菌株16S rRNA全基因序列共1391bp(Genbank登录号为：JQ083404)；

与Genbank国际基因序列数据库记录的最相似的菌株Pedobacter terricola DS-40T(EF446146)的相似性为95.2％。

3.一种权利要求1所述卡拉胶降解菌的酶解产物，其特征在于：卡拉胶降解菌的酶解方法，

1）将卡拉胶降解菌划线于卡拉胶固体培养基上，在25-35摄氏度培养72-96小时；

2）将固体培养基种子接于种子培养基的试管中，接种1-3环，于25-35摄氏度下以150-210rpm转速培养48-72小时；

3）按体积比为1/50~1.5/5将种子培养基接入发酵培养基中，25-35摄氏度下以150-210rpm转速培养48-96小时，获取发酵物。

4.按照权利3所述卡拉胶降解菌的发酵方法，其特征在于：

所述卡拉胶固体培养基（g/L）：琼脂粉：7-15，蛋白胨：3-8，酵母浸出粉0.5-5，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，FeSO₄·7H₂O：0.01-0.05；MgSO₄·7H₂O：0.2-1.0；CaCl₂：0.1-0.5；KH₂PO₄：0.5-4，pH 6.0-8.0，余量为水；

所述种子培养基（g/L）：酵母浸膏：0.5-5，蛋白胨：2-10，卡拉胶：1-10，氯化钠：0-20，pH6.0-8.0，余量为水；

所述发酵培养基（g/L）：卡拉胶0.2-1，蛋白胨2-8，酵母浸出粉：0.5-5，FeSO₄·7H₂O：0.01-0.05；MgSO₄·7H₂O：0.2-1.0；CaCl₂：0.1-0.5；KH₂PO₄：0.5-4，用水补足1000ml，pH 6.0-8.0。

5.一种权利要求3所述卡拉胶降解菌的酶解产物在生产卡拉胶寡糖中的应用，其特征在于：

利用卡拉胶降解菌的酶解产物中产生的卡拉胶降解酶生产卡拉胶寡糖，也可称之为卡拉胶降解菌（Pedobacter hainanensis sp.）13-Q用于生产卡拉胶寡糖；

1）收集发酵粗酶液：将按照权利要求3得的发酵液，经10000g离心10分钟去除菌体，上清液经60％饱和硫酸铵在4摄氏度搅拌过夜，12000g离心30分钟，收集沉淀，用PBS缓冲液（0.02-0.05M，pH 7.0-8.0）重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，得粗酶液；

酶解底物：于反应器中进行反应，将粗酶液加入卡拉胶底物中，使1000ml体系中卡拉胶底物质量为5-20g、粗酶液2-10ml、余量为水，于30-40℃，pH 7.0-8.0条件下酶解反应3-9小时，将反应器置于沸水10-15分钟终止反应；得的卡拉胶寡糖溶液粗产品；

2）分离产物：所得的卡拉胶寡糖溶液粗产品，经过除去酶蛋白质（Sevage法）后，于真空旋转蒸发仪中去除水分，或经喷雾干燥或冷冻干燥去除水分，得到卡拉胶寡糖产物。