[发明专利]一种修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法

权利要求书

1.一种修复半月板撕裂的生物材料，其特征在于：由多层结构组成，即，依次由内层的脱细胞基质膜、中间层的多孔结构的胶原基质膜、外层的软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片构成；中间层与内层通过注模、流延或刮板工艺方法复合，外层通过软骨细胞接种胶原基质膜制备复合结构，完成生物材料制备。

2.根据权利要求1所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于，依下述步骤完成：

步骤一、脱细胞基质膜的制备:该脱细胞基质膜选用动物源性脱细胞基质膜或人源性的脱细胞羊膜，以传统工艺制备而成；

步骤二、具有多孔结构的胶原基质膜的制备：配置浓度为3～15mg/mL、pH值为3～6的胶原溶液，在脱细胞基质材料致密面通过注模、流延或刮板制备多孔胶原涂层；通过预冻温度设定、冷冻速度和冻干工艺来调节胶原层孔径大小，控制其孔径大小在50～600μm之间；

步骤三、软骨细胞形成的细胞层及细胞膜片的制备：

细胞层软骨细胞接种：用软骨细胞培养液浸润步骤二制备的胶原基质膜后，按1×10⁴～2×10⁶/cm²密度接种软骨细胞于胶原涂层多孔表面，静置0.5～4小时，加入软骨细胞培养液2～4mL，液面下培养2～4天，待细胞在多孔胶原基质膜内胶原纤维束贴附后，去除培养基；随后，将接种软骨细胞的胶原基质膜加入旋转细胞维持培养液中，该旋转细胞维持培养液为软骨细胞培养液，进行旋转培养，完成半月板损伤修复材料的制备：

细胞膜片制备：待完成细胞层接种后，翻转胶原基质膜，置于细胞培养用孔板。采用同样方法将软骨细胞接种脱细胞基质材料疏松面表层，液面下培养 2～7天；后期旋转培养参照步骤四完成制备。

3.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤1所述的动物源性脱细胞基质膜或人源性的脱细胞羊膜，是脱细胞小肠粘膜下层、脱细胞心包膜、脱细胞腹膜。

4.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤二所述调节胶原层孔径，控制孔径大小更优在200～400μm之间。

5.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤二所述的胶原溶液，是用牛跟腱、皮肤、鼠尾的动物源性材料制备而成。

6.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤二所述制备多孔胶原涂层的方法是：对复合后材料采用物理交联或化学交联，或者二者结合的方式；

所述物理交联——采用紫外光照射交联(4～15小时)或者重度脱水交联（如乙醇、丙酮、异丙醇）；

所述化学交联——采用异氰酸盐类（HDI）、酰基叠氮类（DPPA）、醌类（NDGA）、碳化二亚胺（EDC）、环氧化合物（EC）及其低聚物、聚乙二醇等化学交联剂，也可以采用葡萄糖、核糖等生物交联剂；交联材料采用PBS缓冲液、生理盐水、纯水清洗后，冻干，环氧乙烷灭菌后备用。

7.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤三所述软骨细胞培养液,其组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有胎牛血清100ml/L、非必需氨基酸10ml/L、丙酮酸钠1mmol/L、L-谷氨酰胺10-500μg/mL、维生素c（Vc）为50～100μg/mL、转化生长因子（TGF-β₁）为5pg/mL～20ng/mL、碱性成纤维生长因子-2（bFGF-2）为5～50ng/mL，血小 板源性生长因子（PDGF-bb）为1～10ng/mL、胰岛素样生长因子（IGF-1）1～50ng/mL。

8.根据权利要求2所述修复半月板撕裂的生物材料的制备方法，其特征在于：步骤三所述的软骨细胞，是软骨细胞或可向软骨细胞分化的间充质干细胞。