[发明专利]维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种云南紫杉树皮中提取的影响肿瘤细胞增殖及周期调控的化合物，属于肿瘤局部介入治疗药物开发领域的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

背景技术

肿瘤是指人体器官组织的细胞，在外来和内在有害因素的长期作用下所产生的一种以细胞过度增殖为主要特点的新生组织。这种新生组织与受累器官的生理需要无关，不按正常器官的规律生长，破坏了原来器官结构，丧失正常细胞的功能，从而使细胞呈现异常的形态，细胞的功能和代谢发生紊乱。另外，肿瘤细胞还能向周围浸润蔓延，甚至扩散转移到其他器官组织，危及生命。

目前，恶性肿瘤已成为危害人类健康最严重的疾病之一，仅次于心脑血管疾病，位列致死病因的第二位.世界卫生组织预测，到2020年，将有2000万新发癌症病例，其中死亡人数达1200万，且绝大部分将发生在发展中国家。临床常用治疗肿瘤的方法有外科手术、化学疗法、放射疗法，但这些方法通常具有严重的副作用，患者常因免疫功能受创，出现远处播散、肿瘤转移，使得生活质量下降、生存期缩短。因而近年来从天然药物中寻找高效低毒的抗肿瘤药物成为研究热点，迄今已成功开发出紫杉醇、长春新碱、足叶乙甙等一大批植物中获取的化学成分并已成功应用到恶性肿瘤的一线临床治疗中。

发明内容

本发明的目的在于维康醇对HeLa肿瘤细胞增殖及对此细胞周期调控的影响进行研究，寻找其作用靶点，为维康醇将来的研究和开发提供理论依据的维康醇在制备治疗宫颈癌药物中的应用。

本发明的目的是通过下述方案实现的

其实验方法：

(1)主要试剂的配制，其中包括DMEM培养基配制、维康醇的配制、胰酶的配制、PI染色液的配制

(2)细胞培养

(3)Hechs染色观察细胞形态

(4)细胞周期测定

(5)Western Blotting实验，其中包括主要试剂配制、样品制备、蛋白含量测定、样品进行SDS.PAGE电泳、转膜

(6)Cyclin D1，Cdk4，P21含量的测定

(7)半定量RT-PCR，其中包括细胞总RNA的提取、cDNA第一条链合成、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳

(8)数据处理

(9)实验结果，其中包括Hoechst33258染色观察细胞形态、维康醇对HeLa细胞周期调控的影响、维康醇抑制细胞周期蛋白(cyclin D1)的表达、维康醇对HeLa细胞中Cyclin D1，CDK4，P21表达的影响、半定量RT-PCR检测细胞周期相关蛋白mRNA水平的表达

维康醇是一种分子量为352，结构式见图一，它是从云南紫杉树皮中获取一种微生物菌诱变株，经过发酵、纯化等工艺从该菌的菌丝体及培养基中分离出一种新型单体化合物。到目前为止，维康醇的抗肿瘤作用未见研究。因此，本研究的目的就是对维康醇抑制肿瘤细胞增殖的机理进行初步研究，寻找其作用靶点，为维康醇将来的研究和开发提供理论依据。

本实验拟采用SRB法，检测不同浓度维康醇对人宫颈癌HeLa细胞株的增殖抑制作用来研究维康醇的抗肿瘤机制。

附图说明：

图1为配制1mg/ml的BSA(牛血清白蛋白)，0.15M NaCl，在取样管中加入试剂的量

图2为cDNA合成体系

图3为扩增体系

图4为扩增引物及退火温度

图5为Hoechst33258染色观察细胞形态

图6为流式细胞仪测定细胞周期

图7为维康醇抑制细胞周期蛋白(cyclin D1)的表达

图8为维康醇对HeLa细胞中细胞周期相关蛋白的表达量的影响

图9为半定量RT-PCR检测细胞周期相关蛋白的表达

具体实施方式

下面结合附图对本发明进行详细说明：

具体方案：