[发明专利]甲型肝炎病毒株HAV-ZL2012，由其制备得到的疫苗及应用

权利要求书

1.一株甲型肝炎病毒株，命名为HAV-ZL2012，其由该病毒株的传染性克隆感染细胞后产生，所述的该病毒株的传染性克隆存在于甲型肝炎病毒工程菌中，所述的甲型肝炎病毒工程菌，命名为pHAV-ZL2012/DH5α，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.6215，保藏日期为2012年6月14日。

2.权利要求1所述的甲型肝炎病毒株在制备预防由甲型肝炎病毒引起的疾病的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物为甲肝减毒活疫苗或甲肝灭活疫苗。

4.权利要求1所述的甲型肝炎病毒株在制备甲肝的诊断试剂中的应用。

5.一种甲肝疫苗，其特征在于所述的疫苗中含有权利要求1所述的甲型肝炎病毒株。

6.如权利要求5所述的疫苗，其特征在于所述的疫苗为甲肝减毒活疫苗或甲肝灭活疫苗。

7.一种使甲型肝炎病毒株快速减毒适应的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将甲型肝炎病毒株在FRhK6的单层细胞上传代10次后，转至Vero细胞，Vero细胞传至第10代，病毒培养液经ELISA-TCID₅₀测定病毒滴度，RT-PCR检测阳性；

（2）在二倍体细胞上的减毒适应

将步骤1中得到的在Vero细胞上传至第10代的细胞，按0.01-0.1MOI接种单层二倍体MRC-5细胞，传至5-8代，病毒培养液经ELISA-TCID₅₀测定病毒滴度，RT-PCR检测阳性，得到所述病毒株的二倍体细胞适应株；

（3）二倍体细胞适应株在Vero细胞上的传代和适应

细胞培养瓶形成Vero细胞单层后用不含胎牛血清的MEM培养液洗3次，接种人二倍体细胞上适应的甲肝病毒株，经32℃4小时的吸附，每隔1周换液1次，每4周至6周传代一次，每次传代细胞经冻融超声，经5-7次传代后，病毒液按10-100倍稀释，用ELISA测定滴度，继续在32℃下每2周传代一次，传至25-30代次时，进行RT-PCR检测；

（4）中和实验或免疫电镜观察

步骤3得到的培养物经冻融、超声处理，离心，取上清液0.05ml加入0.02ml人的免疫血清后，以1:10或1:20的体积比与稀释液混合，在37℃孵育1小时，4℃冰箱放置3小时，进行电镜观察，混合液接种二倍体单层细胞，培养二周，RT-PCR检测结果阳性，用ELISA-TCID₅₀检测不到病毒滴度，即得。