[发明专利]一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法。

技术背景

L－丝氨酸是一种非必需氨基酸，具有许多重要的生理功能，在医药、食品等领域有着较为广泛的应用。目前合成L-丝氨酸的方法主要有化学合成法、蚕丝水解法、酶法以及前体发酵法等生物法，其中化学合成法生产出的产品为D－丝氨酸和L－丝氨酸的混合物；蚕丝水解法操作复杂，还需要处理大量的洗脱液，所得氨基酸为混合氨基酸；酶法合成时对固定化酶要求较高，且从酶反应液中分离L-丝氨酸一直是酶法生产的难点；前体发酵法中由于前体物质甘氨酸价格昂贵，通过此方法生产的L－丝氨酸无法满足市场的需求。由于现有L-丝氨酸生产方法中存在较多技术难题，直接发酵法生产L－丝氨酸成为当今研究的一大热点。但是L－丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，参与了许多生物物质的合成，如氨基酸类－甘氨酸、色氨酸，核酸碱基类－磷脂酰丝氨酸、嘌呤等，由于此类物质的代谢运转速度极快，因此，L－丝氨酸的直接发酵法生产十分困难。近年来，随着分子生物学的发展，采用基因工程手段对相关酶的基因进行改造，以改变酶的某些特性，实现对代谢途径进行更为精确快速的调控。

本发明所用的大肠杆菌是一种模式生物，由于其遗传背景清楚，操作技术成熟等特点，已经广泛用于遗传、代谢工程等诸多领域。通过基因工程改造的大肠杆菌，诸如谷氨酸发酵及乳酸发酵等途径已成功构建。在大肠杆菌中L－丝氨酸能进一步被sdaA、sdaB、tdcG所编码的同工酶即脱水酶所催化利用，产生一些非必需的代谢产物。

Elaine Newman等（2008,MolecμLar Microbiology.69(4),870–881）描述了大肠杆菌MEW999菌株中sdaA、sdaB、tdcG三个基因同时缺失后对菌体生长和分裂的影响，但并未测定L－丝氨酸的积累量，也未进行发酵条件的优化。而国内有关于在大肠杆菌代谢途径及其调控方式的基础上构建同时缺失sdaA、sdaB和tdcG三个基因的工程菌株的专利还未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌及其发酵方法，本发明通过基因工程技术，对大肠杆菌进行基因敲除，以获得同时缺失sdaA、sdaB和tdcG基因且L-丝氨酸积累量提高的工程菌株，并利用该工程菌株进行发酵条件优化，以确定其最优的发酵条件为：pH值为7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h；发酵培养基组成为蛋白胨10g/L，酵母粉5gL、氯化钠10gL、葡萄糖10g/L，最终使L－丝氨酸在菌体中积累量提高了约40%。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌，该菌株分类为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）；保藏日期：2012年6月13日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC6213，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

而且，所述菌株的基因型为MG1655△sdaA△sdaB△tdG：：Cm。

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌在构建磷脂酰丝氨酸高产菌株中的应用。

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵方法，其特征在于：发酵条件为：pH值为7.0，温度37±1℃，摇床转速200±20转/min，发酵时间48±3h；

一种高产L－丝氨酸的大肠杆菌工程菌的发酵方法，其特征在于：发酵培养基组成为：蛋白胨10gL，酵母粉5gL、氯化钠10g/L、葡萄糖10g/L。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明在分析大肠杆菌代谢途径及其调控方式的基础上，设计并构建了一株应用于高产L－丝氨酸的同时缺失sdaA、sdaB和tdcG基因工程菌株，并使L－丝氨酸的积累量提高了约40%。本发明构建的菌株为进一步构建以L－丝氨酸为底物合成磷脂酰丝氨酸的高产菌株奠定了基础，具有重要的实用意义。

附图说明

图1为本发明中大肠杆菌菌体内L－丝氨酸的代谢途径；

图2为本发明所构建菌株中sdaA基因敲除验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker1、2、3:sdaA基因成功敲除4:sdaA基因未敲除；

图3为本发明所构建菌株中sdaB基因敲除验证的核酸电泳图其中M:DNAMarker 1、2:sdaB基因成功敲除3:sdaB基因被氯霉素基因替换；