[发明专利]一种人心肌肌钙蛋白I适配子及筛选方法和应用

权利要求书

1.一种人心肌肌钙蛋白I适配子，其特征在于：具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的人心肌肌钙蛋白I适配子，其特征在于：所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：

3.一种如权利要求1所述的人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选方法，其特征在于：步骤如下：

⑴合成随机ssDNA文库

合成长度为81bp的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间19个碱基为随机序列；

P81库：5'-CGG GAA TTCTAT GGC GGA TGG GAG CGAN19GCC GCA AGA AAAAGT TTG AGA GCAAGC TTC CG-3′。

其中：上游引物为：序列5；下游引物为：序列6；

⑵人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选

将人心肌肌钙蛋白I按照表1中的量包被，包被液为pH9.6，0.05mol/LNaHCO₃，于4℃过夜，同时设空白对照孔，其样品孔和空白对照孔均加入50μL3%BSA封闭2h，4℃过夜；

将合成的随机ssDNA文库配制成浓度为100μmol/L的溶液；将200μL结合缓冲液与随机ssDNA文库按照表1中的文库量进行混合，在90℃下加热变性5min后，迅速置于冰上10min，然后室温变性15min；

再将已变性的ssDNA先与由3%BSA封闭的空白对照孔结合，37℃孵育，然后转移到人心肌肌钙蛋白I包被孔与人心肌肌钙蛋白I结合，37℃孵育40min，反筛除去与BSA结合ssDNA；

用洗涤缓冲液洗涤，洗去未结合心肌肌钙蛋白I的ssDNA；

在人心肌肌钙蛋白I与ssDNA结合的孔中加入洗脱缓冲液，80℃下培养10min，洗脱下与人心肌肌钙蛋白I结合的ssDNA；

向洗脱液中加入等体积的酚：氯仿抽提，震荡混匀后4℃、10000rpm离心5min，吸上清，向上清中加入2倍上清液体积的无水乙醇沉淀ssDNA，4℃、10000rpm离心5min，弃去上清，用1mL70%乙醇洗涤沉淀，37℃倒置烘干；

将沉淀溶解于20μL TE缓冲液中，贮存于-20℃，作为PCR反应的模板；

⑶PCR扩增单链DNA过程

PCR扩增引物：上游引物：序列5；下游引物：序列6；

扩增模板为步骤⑵中洗脱纯化的ssDNA，其扩增的反应条件为：94℃预变性3min；然后，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，12个循环；最后，72℃延伸7min；

反应体系25μL：ssDNA模板1μL，10×PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL，10mM的dNTPs2.5μL，10pmo l的上、下游引物各2μL，，Taq酶0.2μL，灭菌双蒸水13.3μL；

⑷不对称PCR制备ssDNA次级文库

上游引物：序列7；下游引物：序列8；上游引物：下游引物的比例为80：1；

扩增模板为步骤⑶中的PCR扩增产物，其扩增的反应条件为：94℃预变性3min；然后，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环；最后，72℃延伸7min；

反应体系25μL：ssDNA模板1μL，10×PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL，10mM的dNTPs2.5μL，10pmol的上游引物和下游引物的量共为4μL，Taq酶0.2μL，灭菌双蒸水13.3μL；

表1心肌肌钙蛋白I蛋白适配子的12轮筛选的参数

4.权利要求1或2所述的人心肌肌钙蛋白I适配子在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化。