[发明专利]一种用于检测变形球囊霉的种特异性引物对

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测变形球囊霉的引物对。

背景技术

变形球囊霉(Glomus versiforme)是一种丛枝菌根(arbuscular mycohizal，AM)真菌，为寡营养活体微生物，能够侵染部分陆生植物根系形成菌根。变形球囊霉能够促进植物对各种营养元素的吸收，提高植物抗病抗旱能力等，而且在维持植物的多样性和生态系统的稳定性等方面起着极其重要的作用。

目前，可以利用湿筛倾析-蔗糖离心法从植物根际土壤中获得AM真菌的单个孢子，然后提取其DNA，再使用真核生物通用引物对LR1/NDL22将其扩增出来，通过测序知道其准确的基因序列。然而，从具有多种AM真菌的土壤样品中，尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中直接扩增出具有变形球囊霉(Glomus versiforme)遗传特性的25S rDNAD1/D2可变区域的部分序列，给AM真菌侵染根系的检测研究带来了困难，并且以往的研究中所设计的引物对LR1/G.ver也不能特异性地从混合样品中扩增出相应的特异性DNA片段。

发明内容

本发明要解决现有的引物对无法准确地从含有多种AM真菌的样品中直接检测出具有变形球囊霉(Glomus versiforme)遗传特性的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列，且现有引物对LR1/G.ver也不能特异性地从混合样品中扩增出相应的特异性DNA片段的问题，而提供一种用于检测变形球囊霉的种特异性引物对。

用于检测变形球囊霉的种特异性引物对命名为G.ver F/G.ver R，由正向引物G.ver F和反向引物G.verR组成，正向引物G.verF的碱基序列为5′-GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3′，反向引物G.ver R的碱基序列为5′-GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3′。

本发明用于检测变形球囊霉的种特异性引物对是根据变形球囊霉25S rDNA中D2区特异性序列而设计。

本发明用于检测变形球囊霉的种特异性引物对作为PCR扩增的引物，可从含有多种AM真菌的土壤样品和菌根中快速准确地检测其中是否含有变形球囊霉(Glomus versiforme)，含有变形球囊霉的能扩增出长度为537bp的变形球囊霉特异性目的片段。本发明引物为快速准确检测土壤样品中的变形球囊霉奠定了基础。

附图说明

图1是具体实施方式一中利用引物对G.ver F/G.ver R对变形球囊霉进行PCR扩增检测的检测结果图，图1中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为引物对G.ver F/G.ver R的PCR扩增产物。图2是具体实施方式二中利用引物对LR1/G.ver对变形球囊霉进行PCR扩增检测的检测结果图，图2中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为引物对LR1/G.ver的PCR扩增产物。图3是具体实施方式三中分别利用引物对LR1/G.ver和引物对G.ver F/G.ver R对人为添加变形球囊霉的含有多种AM真菌的土壤样品进行PCR扩增检测的检测结果图，图3中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为引物对LR1/G.ver的PCR扩增产物，“2”泳道标样为引物对G.ver F/G.verR的PCR扩增产物。图4中“M”泳道标样为Marker，“1”泳道标样为引物对G.ver F/G.ver R的PCR扩增产物，“2”泳道标样为引物对LR1/G.ver的PCR扩增产物。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对命名为G.ver F/G.verR，由正向引物G.ver F和反向引物G.ver R组成，正向引物G.ver F的碱基序列为5′-GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3′，反向引物G.verR的碱基序列为5′-GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3′。

本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对的PCR扩增体系为50μL，由1.0μL模板DNA、4.0μL浓度为2.5mmol/L的dNTP、5.0μL10×缓冲液(含Mg²⁺)、5.0μL浓度为10pmol/L的引物(G.ver F和G.ver R的终浓度)、0.2μL浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶和余量无菌双蒸水组成。