[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1. 一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：其是由猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株接种Marc-145细胞，猪细小病毒强毒株接种ST细胞，分别收获感染细胞培养液经甲醛溶液灭活、超滤浓缩后混合得到的混合病毒液再与油佐剂混合乳化制成；其由以重量份计的1-2份油佐剂和1份混合病毒液水相组成。

2. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：所述油佐剂由以重量份计的注射用白油：90-95份、司本-80：5-8份、硬脂酸铝1-3份组成。

3. 根据权利要求2所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：所述混合病毒液水相由以重量份计的95-98份混合病毒液、2-5份吐温-80组成。

4. 根据权利要求3所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：所述混合病毒液是浓缩的猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液与浓缩的猪细小病毒感染细胞培养液按照体积比为1:1的比例混合液。

5. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗，其特征在于：其中灭活前，猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液中PRRSV病毒含量为2×10^6-7TCID₅₀/ml，猪细小病毒感染细胞培养液中PPV病毒含量为2×10^6-7TCID₅₀/ml。

6. 一种猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤

1）猪繁殖与呼吸综合征病毒液的制备：将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株按体积比5%的量接种已长成单层的Marc-145细胞，旋转培养，当70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理，之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液；

2）猪细小病毒液的制备：采用同步接种方法，在ST细胞分瓶传代的同时，按体积比为1～2%的量同步接种猪细小病毒强毒株，培养至70%以上细胞出现细胞病变时，收获猪细小病毒感染细胞培养液，冻融，经离心或过滤除去细胞碎片，再用甲醛溶液进行灭活处理；之后再通过超滤浓缩浓缩至原体积的一半，得到浓缩猪细小病毒液；

3）油相制备：将注射用白油：90-95份、司本-80：5-8份混合后加热、再加入硬脂酸铝1-3份，随加随搅拌到透明为止，灭菌后制得油相；

4）水相制备：取步骤1）的浓缩猪繁殖与呼吸综合征病毒液和步骤2）中的浓缩猪细小病毒液按体积比为1∶1的比例混合，搅拌均匀，得到混合病毒液，然后取混合病毒液95-98份，灭菌冷却后的吐温-80 2-5份，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；

5）乳化：取油相1-2份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入1份水相，搅拌使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗。

7. 根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤1）中旋转培养的温度为37℃，旋转速度为8～9转/小时，所用的培养液为含质量浓度为2%胎牛血清的DMEM细胞培养液；用终浓度为0.1%的甲醛溶液进行37℃灭活处理，灭活时间为16-20小时。

8. 根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤2）中培养时温度为37℃，培养时间为72～96小时；用终浓度为0.1%的甲醛溶液于37℃灭活处理15-20小时。

9. 根据权利要求6所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤5）中搅拌速度为3000r/min，搅拌时间为30-60分钟。

10. 一种如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株-猪细小病毒病二联灭活疫苗应用于建立猪繁殖与呼吸综合征-猪细小病毒病二联灭活疫苗质量标准。